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1、蛋白质的性质实验蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、实验目的一、实验目的v（1）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。应原理。v（2）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。酸的方法。二、实验原理二、实验原理v双缩脲反应双缩脲反应v尿素加热至尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反
2、应。可用于蛋白质的定性或定双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。量测定。v双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个有一个肽键和一个CSNH2，CH2NH2，CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH或或CHOHCH2NH2等基团的物质也有此反应。等基团的物质也有此反应。NH3干扰此反干扰此反应，因为应，因为NH3与与Cu2+可生成暗蓝色的络离子可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质
3、有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。或多肽。茚三酮反应茚三酮反应v除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，紫色物质。该反应十分灵敏，1 1 500 000浓度的氨基浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。方法。v茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还
4、原型茚三酮；和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。子和氨缩合生成有色物质。v此反应的适宜此反应的适宜pH为为57，同一浓度的蛋白质或氨基，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。显色。黄色反应黄色反应v含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。v多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入
5、少量浓硫酸才有黄色反应。乙醛酸反应乙醛酸反应v在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。三、仪器、材料和试剂三、仪器、材料和试剂实验仪器实验仪器试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；水浴锅。瓶；水浴锅。实验材料和试剂实验材料和试剂尿尿素素；10%氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液；1%硫硫酸酸铜铜溶溶液液；2%卵卵清清蛋蛋白白溶溶液液；0.5%甘甘氨氨酸酸溶溶液液；0.1%茚茚三三酮酮水水溶溶液液；大大豆豆提提取取液液；头头发发；指指甲甲；0.5%
6、苯苯酚酚溶溶液液；浓浓硝硝酸酸；0.3%色色氨氨酸酸溶溶液液；0.3%酪酪氨氨酸酸溶溶液液；冰冰醋醋酸、浓硫酸。酸、浓硫酸。四、操作步骤与方法四、操作步骤与方法 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加形成双缩脲。冷后，加10%10%氢氧化钠溶液约氢氧化钠溶液约1ml1ml，振荡混匀，振荡混匀，再加再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液1 1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜
7、，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml1ml和和10%10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液2ml2ml，摇匀，再加，摇匀，再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液2 2滴，随加随摇。观察紫玫瑰滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。色的出现。双缩脲反应实验操作双缩脲反应实验操作茚三酮反应实验操作茚三酮反应实验操作v取取2 2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液液1ml1ml，再各加，再各加0.5ml0.1%0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混茚三酮水溶液，混匀，在沸
8、水浴中加热匀，在沸水浴中加热1212分钟，观察颜色由粉分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。色变紫红色再变蓝。v在一小块滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液，甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴风干后，再在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。出现。黄色反应实验操作黄色反应实验操作v向向7 7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加火
9、加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入入10%10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。管 号1234567材 料（滴）鸡蛋清溶液4大豆提取液4指甲少许头发少许0.5%苯酚40.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）244040444现象乙醛酸反应实验操作v 取取3 3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2 2毫毫升，混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓升，混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约硫酸约1 1毫升，静置。观察各管液面间紫色环的毫升，
10、静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可于水浴中微热。出现。若不明显，可于水浴中微热。试剂管号水滴0.03%色氨酸溶液（滴）蛋白质溶液（滴）冰醋酸（ml）浓硫酸（ml）现 象1-521241-2135-21五、思考题：v1.1.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。调？并说明原因。v2.2.你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。v3.3.能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？存在？v4.4.哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？结果？