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1、Transgenic TechnologyTransgenic TechnologyDefinition Transgenic technology refers to the genetic engineering of an organism so that its genomic DNA is altered to over-or underexpress certain genes.Transgenic techniqueGene Knock OutGene Knock InGene Knock DownGene Trappingmouse,rabbit,rat,sheep,pig,c
2、aw etc.The 2007 Nobel Prize in physiology or medicine is awarded for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells.Oliver Smithies Martin J.Evans Mario R.CapecchiEvanss work:The ES cellsStem cellMartin talks about his work embr
3、yonic stem cell，ES somatic stem cellMario Capecchi and Oliver Smithies,independently of each other,discovered how homologous recombination between segments of DNA molecules can be used to target genes in the mammalian genome and developed methods to generate genetically modified mice.转基因小鼠构建过程构建打靶载体
4、ES细胞打靶和筛选囊胚注射动物杂交筛选北京诺兰信科技北京高校生物技术转化平台25 Health Sciences Drive Stony Brook,NY 11790-3350，USA一、打靶载体定点突变技术STRATAGENE，Agilent Technologies Inc分子开关-Cre/Loxp 系统Cre：由P1噬菌体编码的约38KD的重组酶，不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列。可以特异性的识别并催化34个碱基重复序列的loxP之间的DNA同源重组。Loxp位点：locus of crossing-over(x)in P1 site:Cre-LoxP系统的
5、特性系统的特性Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方方向相同向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方方向相反向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。两个loxp位点的方向相反CreloxploxpGene Gene promoterpromoterloxploxpKnock-out geneKnock-o
6、ut stop cassetteKnock-out labelFLP/frt重组系统来自啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)其中重组酶FLP可催化位于同一分子上两个同向frt位点间DNA片段的同源重组，实现基因切除的效果。作为“第二分子开关”FLP/frt系统与Cre/loxP系统一起，更精密的调控基因表达时间控制和组织特异性表达Cre的表达还可以通过在启动子上引入相应某种配体的元件(比如某种药物)而达到时间控制时间控制和组织特异性表达组织特异性表达。四环素、1型干扰素、三苯氧胺(Tamoxifen，可以与一种与雌激素受体相互作用的蛋白相结合)都被用于获得药物诱导型的启
7、动子。LSL-Cre :loxp-stop-loxp,CreFSF-Flpo:FRT-stop-FRT,FlpoEstablished Lung TumorsSi-Bmi-1二、ES细胞打靶和筛选HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶，自杀基因自杀基因HSVtk基因的产物使细胞能利用培养基中的GANC(Gancyclovir，丙氧鸟苷）而死亡例如将在肝癌细胞中可表达AF基因的调控区与水痘一带状疮疹病毒中的胸苷激酶（VZV-TK）基因进行重组，构建逆转录病毒载体导入体内，TK基因只在肝癌细胞中表达，产生的TK可催化6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷磷酸化产生araAMP，进一步磷酸化形成细胞毒物质araATP
8、，杀死肝癌细胞。Neo基因 卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷新霉素磷酸转移酶酸转移酶II，基因记做neo，能通过降解G418、新霉素和卡那霉素来实现真核和原核细胞的相应抗性。一般应用于原核生物就是卡那霉素抗性基因,应用于真核生物就是G418抗性。外源基因导入ES细胞的方法有:1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法 三、囊胚注射和杂交筛选小鼠基因型的鉴定？标准品系：标准品系：ES细胞品系：E14Tg2a(129背景)；JM8(C57BL/6N品系)；JM8A3(C57BL/6N 品系，Agouti毛色)注射用囊胚品系：C57BL/6C57BL/6129和C57BL
9、/6纯系小鼠 近交系Inbred MiceC57BL/6129C57BL/6品系较纯，回交较少代数后性状就能稳定。129品系ES细胞的优点是它们比较皮实，容易操作。C57BL/6 ES cell比较娇嫩。表表1.用基因打靶法制用基因打靶法制备的一系列重要的基因敲除小鼠及表型：的一系列重要的基因敲除小鼠及表型：敲除基因敲除基因表表现型型RAG-1和和/或或RAG-2 因无因无TcR基因重排而无基因重排而无T细胞胞TcR 双阴性胸腺双阴性胸腺细胞聚集，双阳性胸腺胞聚集，双阳性胸腺细胞很少，胞很少，TcR正常重排正常重排TcR 有双阴和双阳有双阴和双阳T细胞而无胞而无单阳性阳性T细胞胞P56lck
10、T细胞胞发育在早期双阳性成熟期受阻，无育在早期双阳性成熟期受阻，无 T细胞胞CD3-T细胞胞发育在早期双阳性成熟期受阻育在早期双阳性成熟期受阻CD45 T细胞胞发育在双阳性成熟期受阻育在双阳性成熟期受阻MHC-,不不变链无无CD4+T细胞，胞，CD4+CD8-/+很少，正常很少，正常NK，1.1+CD4+,CD8+正常正常 CD4 CD8+数量和功能正常数量和功能正常MHC-，2微球蛋白微球蛋白无无CD8+T细胞，胞，CD4+T细胞正常胞正常TAP1/TAP2TcR-无无 T细胞，胞，对结核杆菌易感性增加核杆菌易感性增加P59fyn T细胞胞发育正常，育正常，T细胞胞应答缺答缺损IgM穿膜区穿
11、膜区晚期晚期CD43+B聚集，无等位基因排斥聚集，无等位基因排斥5 CD43+细胞聚集，部分成熟胞聚集，部分成熟B细胞出胞出现延延迟IL2 IgG1,IgG2a，IgG2b自身抗体增加自身抗体增加CD40L 高高IgM,无生无生发中心，低中心，低IL12和和IFN，巨噬，巨噬细胞活化受阻胞活化受阻CD28 IgG1，IgG2b减少减少 转基因动物的维持Duke University Laboratory Animal Resources Center 胚胎的冷冻保存国家遗传工程小鼠资源库联系人：郭仕英联系电话：网址：地址：南京市浦口区学府路12号The Jackson LaboratoryTe
12、lephoneFaxMail:The Jackson LaboratoryCustomer Service610 Main StreetBar Harbor,Maine04609-1500 U.S.A.Online:JAX Mice Online Order Request Form(secure interactive PDF)Email:美国实验动物公司美国实验动物公司 Charles River Laboratories,Inc.251 Ballardvale StreetWilmington,MA 01887-1000For General Inquiries Phone:978-658-6000 Fax:978-658-7132 Email:The end