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1、Transgenic Animals Baiyan WuDepartment of Medical Genetics Peking University 8080年年代代以以来来，分分子子生生物物学学和和哺哺乳乳动动物物胚胚胎胎工工程程学学的的迅迅速速发发展展以以及及两两个个学学科科的的互互相相渗渗透透和和联联系系，使使基基因因可可以以在在实实验验室室条条件件下下，从从一一个个动动物物体体内内分分离离出出来来，进进行行增增值值修修饰饰，再再引引入入同同种种或或异异种种动动物物胚胚胎胎中中，并并在在个个体体发发育育中中得得到到表表达达，形形成成转转基基因因动动物物(Transgenic Anim
2、als)。转转基基因因动动物物的的产产生生实实现现了了人人们们构构建具有目的性状的动物的意愿。建具有目的性状的动物的意愿。一、转基因动物的概念一、转基因动物的概念 转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物（transgenic animal）:基因组基因组中整合的外源基因能够表达的一类动物称为转中整合的外源基因能够表达的一类动物称为转基因动物。基因动物。转转转转基基基基因因因因首首首首建建建建者者者者(transgenic founder):):经经过过遗遗传传操操作作的的胚胚胎胎发发育育而而来来的的基基因因组组上上整整合合有有外外源源基因的动物。基因的动物。嵌嵌嵌嵌合合合合体体体体动动动动物
3、物物物(chimera animal):):只只有有部部分分组组织织细细胞胞的的基基因因组组中中整整合合有有外外源源基基因因的的动动物物称称为为嵌嵌合体动物。合体动物。二、转基因动物的研究概况二、转基因动物的研究概况19491949年年HammondHammond报报道道了了卵卵子子在在体体外外培培养养的的方方法法.引引发发了一系列的胚胎体外操作实验了一系列的胚胎体外操作实验胚胎工程学胚胎工程学.19661966年年，LinLin首首次次报报道道了了显显微微注注射射方方法法.15.15年年后后才才得得到第一个转基因小鼠到第一个转基因小鼠.19771977年年，GurdonGurdon在在用用m
4、RNAmRNA和和DNADNA注注射射爪爪蟾蟾卵卵的的实实验验中中观观察察到到转转移移的的核核酸酸能能发发生生作作用用。19801980年年，BrinsterBrinster等用小鼠受精卵作了类似的实验等用小鼠受精卵作了类似的实验.19801980年，年，Gordon Gordon 将将SV40SV40以及以及HSVHSV的的TKTK基因整合后的基因整合后的质粒，用显微注射法注入小鼠受精卵的雄原核内，首质粒，用显微注射法注入小鼠受精卵的雄原核内，首次成功地获得了转基因小鼠。次成功地获得了转基因小鼠。19811981年年ConstantiniConstantini和和 WagnerWagner分
5、别分别将家兔的将家兔的-珠蛋珠蛋白基因和人类白基因和人类 -珠蛋白基因与疱疹病毒胸苷酸融合珠蛋白基因与疱疹病毒胸苷酸融合基因注射到小鼠受精卵的雄原核内，成功地获得了转基因注射到小鼠受精卵的雄原核内，成功地获得了转基因小鼠。基因小鼠。19821982年，年，PalmiterPalmiter等将小鼠金属巯蛋白等将小鼠金属巯蛋白(MT)(MT)基因启动子基因启动子片段和大鼠的生长激素（片段和大鼠的生长激素（GHGH）基因的融合基因注入小鼠）基因的融合基因注入小鼠受精卵雄原核内，获得了超级小鼠受精卵雄原核内，获得了超级小鼠“supermouse”Brinsters growth hormone mou
6、se19851985年年Wagner等等第第一一次次使使用用逆逆转转录录病病毒毒载载体体MMCV-neoMMCV-neo感感染染ESES细细胞胞，用用G418G418筛筛选选转转化化细细胞胞,制制成成嵌嵌合合体体，以以neoneo基因为探针检测，各分化组织中均有基因为探针检测，各分化组织中均有neoneo基因的表达。基因的表达。19861986年年，RobertsonRobertson等等用用MPSVmos MPSVmos neoneo逆逆转转录录病病毒毒载载体体转转化化ESES细胞，首次通过细胞，首次通过ES ES 细胞途径获得转基因动物。细胞途径获得转基因动物。19871987年年，Tho
7、masThomas和和SapecchiSapecchi等等首首次次利利用用可可以以正正负负选选择择的的靶靶载载体体，通通过过同同源源重重组组，造造成成了了内内源源HprtHprt-基基因因的的突突变变，获获得得了了内内源源HprtHprt-的的突突变变转转基基因因小小鼠鼠，并并确确定定了了进进行行定定位位整整合合使使用用靶靶载载体体的的基本原则。基本原则。19901990年年，PurselPursel获获得得转转小小鼠鼠乳乳清清酸酸性性蛋蛋白白(whey(whey acidic acidic protein,WAPprotein,WAP）基基因因猪猪，基基因因在在乳乳中中表表达了达了WAPWA
8、P。19921992年年SwansonSwanson等等将将-1-1球球蛋蛋白白和和 -球球蛋蛋基基因因导导入入山山羊羊受精卵，得到转基因山羊中检测到人的血红蛋白。受精卵，得到转基因山羊中检测到人的血红蛋白。19931993年年，爱爱丁丁堡堡药药用用蛋蛋白白质质有有限限公公司司报报道道了了将将抗抗胰胰蛋蛋白白酶酶基基因因注注入入羊羊受受精精卵卵，得得到到具具有有胰胰蛋蛋白白酶酶的的羊羊，可可提取胰蛋白酶用于肺气肿的治疗。提取胰蛋白酶用于肺气肿的治疗。同同年年，荷荷兰兰报报道道了了将将乳乳铁铁蛋蛋白白基基因因注注入入牛牛受受精精卵卵，得得到到的的F1F1海海尔尔曼曼公公牛牛具具有有该该基基因因，
9、F2F2奶奶牛牛的的奶奶中中也也含含有有这种蛋白。可用于治疗人类免疫衰退性疾病。这种蛋白。可用于治疗人类免疫衰退性疾病。近年来通过转基因奶山羊，得到高产量生产抗近年来通过转基因奶山羊，得到高产量生产抗-肿瘤坏死因子的抗体，用于风湿性和类风湿肿瘤坏死因子的抗体，用于风湿性和类风湿性关节炎的根治。性关节炎的根治。20022002年，年，Masaru Okabe Masaru Okabe 实验室成功建立了第一实验室成功建立了第一个应用个应用RNAiRNAi的转基因小鼠。这种转基因小鼠体内的转基因小鼠。这种转基因小鼠体内能产生特异针对能产生特异针对GFPGFP的的siRNAsiRNA，可以在，可以在G
10、FPGFP转基因转基因小鼠全身各个组织内敲低小鼠全身各个组织内敲低GFPGFP的表达。的表达。三、转基因动物的原理及应用三、转基因动物的原理及应用（一）转基因动物的基本原理（一）转基因动物的基本原理（二）转基因动物技术的应用（二）转基因动物技术的应用（一）转基因动物的基本原理（一）转基因动物的基本原理：目的基因（或基因组片段）目的基因（或基因组片段）显微注射等方法显微注射等方法 受精卵或着床前胚胎细胞受精卵或着床前胚胎细胞 移植移植受体动物的输卵管（或子宫）受体动物的输卵管（或子宫）发育发育分析转基因和动物表型的关系分析转基因和动物表型的关系确定外源基因的功能确定外源基因的功能 转基因动物（携
11、带有外源基因）转基因动物（携带有外源基因）培育品种优良的工程动物培育品种优良的工程动物（二）转基因动物技术的应用转基因动物技术的应用1 1、研究基因的结构和功能、研究基因的结构和功能2 2、研究发育过程中基因的特异性表达、研究发育过程中基因的特异性表达3 3、遗传性疾病的研究、遗传性疾病的研究4 4、培育动物新品种、培育动物新品种5 5、构建转基因动物、构建转基因动物生物反应器生物反应器1 1、研究基因的结构和功能、研究基因的结构和功能1 1）组织特异性基因的表达。）组织特异性基因的表达。2 2）通过研究转入外源基因后的新表型，发现）通过研究转入外源基因后的新表型，发现 基因的新功能。基因的新
12、功能。3 3）发现新的基因。导入外源基因后，由于基）发现新的基因。导入外源基因后，由于基 因的随机插入，可能会导致内源基因的突因的随机插入，可能会导致内源基因的突 变，对这些突变进行表型分变，对这些突变进行表型分 析。析。4)4)建立研究外源基因表达、调控的动物模型。建立研究外源基因表达、调控的动物模型。2.2.研究发育过程中基因的特异性表达研究发育过程中基因的特异性表达 外外源源基基因因或或基基因因的的调调控控元元件件进进入入动动物物体体内内后后，对对基基因因表表达达的的时时空空特特异异性性研研究究。研研究究只只能能在在胚胚胎胎期期才才表表达达的的基基因因的的结结构构和和功功能能。将将不不同
13、同外外源源基基因因转转入入宿宿主主受受精精卵卵或或早早期期胚胚胎胎干干细细胞胞，可可观观察察目目的的基基因因在在胚胚胎胎不不同同发发育育阶阶段段的特异表达、关闭及调控机理。的特异表达、关闭及调控机理。3 3、遗传性疾病的研究、遗传性疾病的研究1 1）致病基因的研究）致病基因的研究 将致病基因或病毒基因导入动物，可研究将致病基因或病毒基因导入动物，可研究 外源基因在宿主动物引起的病理变化，探讨发外源基因在宿主动物引起的病理变化，探讨发 病机理。病机理。2 2）建立遗传性疾病的转基因动物模型）建立遗传性疾病的转基因动物模型 这被认为是遗传学研究中继这被认为是遗传学研究中继连锁分析、体连锁分析、体
14、细胞遗传和基因克隆之后细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术。的第四代技术。镰状细胞贫血、地中海贫血、高血压等镰状细胞贫血、地中海贫血、高血压等3 3）探讨生殖细胞的基因治疗方法。）探讨生殖细胞的基因治疗方法。HBVHBV转基因小鼠：对转基因小鼠：对HBVHBV基因在不同组织中表达及其基因在不同组织中表达及其表达产物的生物学效应分析，研究表达产物的生物学效应分析，研究HBVHBV在人体内的在人体内的生活史和致病机理，进行乙肝药物的筛选。生活史和致病机理，进行乙肝药物的筛选。侏儒小鼠侏儒小鼠 (dwarflit mice)(dwarflit mice)：人生长激素缺陷：人生长激素缺陷I I型型模型，
15、由生长激素等位基因隐性突变引起。模型，由生长激素等位基因隐性突变引起。高血压动物模型高血压动物模型转基因猴转基因猴“安迪安迪”：导入了海蜇绿色荧光蛋白基因。：导入了海蜇绿色荧光蛋白基因。2001 The first pet was cloned.The kitten was named CC.Cats have a feline AIDS that is a good model for studying human AIDSPhenotype of Ets2 transgenic mice5.37 g21.88 gA progeroid syndrome in mice is caused
16、by defects in A-type laminsNature,Vol 423,2003abcd het hom WTheart2 mmmyocytesabcdshow smaller myocytesWTMutantaehgfWTMutantMouse Models of Obesity已建立的遗传病转基因动物模型已建立的遗传病转基因动物模型 疾病名称疾病名称 转移基因转移基因 家族性淀粉状蛋白多发神经病变家族性淀粉状蛋白多发神经病变 突变人突变人fransthyretinfransthyretin Lesch-Nyhan Lesch-Nyhan综合征综合征 突变突变HPRTHPRT D
17、owns Downs综合征综合征 CuZn-SODCuZn-SOD Alzheimers Alzheimers 病病 淀粉样蛋白淀粉样蛋白 骨生成不完全骨生成不完全 突变突变（1 1）胶原蛋白前体）胶原蛋白前体 -1-1抗胰蛋白酶缺陷（肺气肿）抗胰蛋白酶缺陷（肺气肿）突变人突变人PiZ PiZ 1-1-抗胰酶抗胰酶 原发性高血压原发性高血压 小鼠小鼠Ren-2Ren-2肾素基因肾素基因 糖尿病糖尿病I I型型 H-rasH-ras临基因；临基因；MHCIMHCI类抗原类抗原H-2kb H-2kb 大鼠胰岛素大鼠胰岛素IIII类抗原类抗原I-A,I-E I-A,I-E 小鼠小鼠MHCIMHCI类
18、抗原类抗原H-2kbH-2kb 糖尿病糖尿病IIII型型 胰岛淀粉样多肽胰岛淀粉样多肽 镰状细胞贫血镰状细胞贫血 人人 和和 8 8globinglobin；人人 2 2珠蛋白和珠蛋白和 8 8Antilles Antilles 人人 2 2珠蛋白和珠蛋白和 8 8 基因基因 人人 2 2和和 8 8珠蛋白基因珠蛋白基因 -地中海贫血地中海贫血 人人 8 8基因基因4 4、培育动物新品种、培育动物新品种 用用转转基基因因技技术术，把把目目的的基基因因导导入入宿宿主主动动物物，使使转转基基因因动动物物具具有有抗抗病病、快快速速增增长长或或增增产产某某些些特特种种蛋蛋白白等等优优良良品品质质。例例
19、:转生长激素基因猪。转生长激素基因猪。5.5.构建转基因动物构建转基因动物生物生物 反应器（反应器（Bioreactor)Bioreactor)用转基因动物用转基因动物生物反应器生产基因药物（肽类药物）。生物反应器生产基因药物（肽类药物）。荷荷兰兰的的生生物物医医药药公公司司用用转转基基因因牛牛生生产产乳乳铁铁蛋蛋白白；英英国国的的罗罗斯斯林林研研究究所所研研究究成成功功的的转转基基因因羊羊，其其乳乳汁汁中中含含有有-抗抗胰蛋白酶胰蛋白酶,可治疗肺气肿。可治疗肺气肿。目目前前国国际际上上利利用用转转基基因因技技术术已已能能生生产产许许多多贵贵重重药药用用蛋蛋白。白。anti-thrombin
20、III(to treat intravascular coagulation)抗凝血酶抗凝血酶IIIIIIhuman blood clotting factors(VIII and IX)人凝血因子人凝血因子human interleukin-2collagen(to treat burns and bone fractures)胶原质胶原质fibrinogen(used for burns and after surgery),纤维蛋白原纤维蛋白原human fertility hormones,生长激素生长激素human hemoglobin,血色素血色素human serum album
21、in(for surgery,trauma,and burns),人血人血清白蛋白清白蛋白lactoferrin(found in mother milk),乳铁蛋白乳铁蛋白tissue plasminogen activator,particular monoclonal antibodies(including one that is effective against a particular colon cancer)6 6、应用于人异种器官移植、应用于人异种器官移植 通过转基因技术，克隆受体的补体调节蛋白基因，通过转基因技术，克隆受体的补体调节蛋白基因，将这种基因转移到供体动物的基因
22、组中，并在心血管内将这种基因转移到供体动物的基因组中，并在心血管内皮表达，避免受体的排斥反应。皮表达，避免受体的排斥反应。19931993年英国培育了年英国培育了3737头含有人体基因的猪，临床试头含有人体基因的猪，临床试验具有安全性。验具有安全性。19991999年，陈实将带有人类基因的猪心，移植到猕猴年，陈实将带有人类基因的猪心，移植到猕猴体内，也度过了排斥反应。体内，也度过了排斥反应。四、转基因动物的构建方法四、转基因动物的构建方法（一）转基因技术（一）转基因技术（二）转基因动物的构建方法（二）转基因动物的构建方法（一）转基因技术（一）转基因技术 基基因因转转移移是是指指将将目目的的基基
23、因因导导入入到到受受体体细细胞胞的的过过程程，它它包包括括三三方方面面的的内内容容：目目的的基因、转化方法，受体细胞。基因、转化方法，受体细胞。根根据据不不同同的的受受体体细细胞胞选选择择不不同同的的转转化方法。化方法。最原始的受体细胞是大肠杆菌最原始的受体细胞是大肠杆菌,它作为它作为受体细胞有以下优点：受体细胞有以下优点：(1)(1)生长迅速生长迅速 (2)(2)容易操作容易操作 (3)(3)大规模繁殖快大规模繁殖快 (4)(4)对其质粒对其质粒DNADNA的分子生物学背景清楚的分子生物学背景清楚 (5)(5)表达调控研究比较全面表达调控研究比较全面1 1、原核生物的基因转移、原核生物的基因
24、转移2 2、真核生物细胞的基因转移、真核生物细胞的基因转移 要要使使外外源源基基因因在在真真核核细细胞胞内内正正确确表表达达，首首先先要构建适当的表达系统，然后再转入细胞。要构建适当的表达系统，然后再转入细胞。方法：方法：(1)(1)磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 (2)EDAE(2)EDAE葡聚糖转染法葡聚糖转染法 (3)(3)电穿孔电穿孔DNADNA转染法转染法 (4)(4)逆转录病毒载体转染法逆转录病毒载体转染法 (5)(5)脂质体转化法脂质体转化法3 3、动物的转基因技术、动物的转基因技术逆转录病毒转导逆转录病毒转导(Retrovirus-Mediation Transgenesis)原核显
25、微注射原核显微注射(Pronuclear Microinjections)胚胎干细胞方法胚胎干细胞方法(Embryonic Stem Cell Method)精子介导法精子介导法(Sperm Mediated Transfer)（1 1）显微注射技术）显微注射技术 是采用显微注射仪对受精卵进行注射，将是采用显微注射仪对受精卵进行注射，将外源外源DNADNA直接注射到受精卵的原核中。直接注射到受精卵的原核中。最先由最先由GordonGordon等人等人(1980)(1980)报道。随后报道。随后Brister(1981)Brister(1981)，Hogan(1986)Hogan(1986)和和
26、Allen(1987)Allen(1987)作了更详细的描述。作了更详细的描述。Pronuclear injection显微注射技术优点显微注射技术优点 1.1.实现基因导入的速度快且操作简单，对实现基因导入的速度快且操作简单，对DNADNA大小无限制大小无限制（最大达（最大达250Kb250Kb）。）。2.2.由由于于是是将将基基因因直直接接导导入入原原核核中中，很很少少产产生生嵌嵌合合体体，有有利利于于对对当当代代基基因因表表达达的的分分析析，并并能能快快速地建立转基因品系。速地建立转基因品系。显微注射技术缺点：显微注射技术缺点：1.1.需要特殊的仪器，包括倒置显微镜和显微需要特殊的仪器，
27、包括倒置显微镜和显微 操操纵仪，拉针仪等。还需要熟练的操作技术。纵仪，拉针仪等。还需要熟练的操作技术。2.2.由于由于DNADNA整合位点难以控制，而且整合拷贝数整合位点难以控制，而且整合拷贝数可从可从1 1几百个，无法作人为的控制。几百个，无法作人为的控制。（2 2）逆转录病毒载体技术）逆转录病毒载体技术 根根据据逆逆转转录录病病毒毒cDNAcDNA能能够够整整合合到到宿宿主主细细胞胞染染色色体体内内的的这这一一特特性性，克克隆隆、构构建建了了多多种种逆逆转转录录病病毒毒载载体体，通通过过转转染染的的方方式式去去实实现现生生殖殖细细胞胞的基因转移。的基因转移。逆逆转转录录病病毒毒进进行行基基
28、因因转转移移，一一般般是是将将去去掉掉透透明明带带的的早早期期胚胚胎胎（8 8细细胞胞胚胚）和和可可产产生生病病毒毒的的成成纤纤维维细细胞胞共共培培养养，感感染染一一定定时时间间后，再进行胚胎移植。后，再进行胚胎移植。逆转录病毒载体技术优点逆转录病毒载体技术优点 1.1.能高效感染宿主细胞，感染率高；能高效感染宿主细胞，感染率高；2.2.能稳定地整合到宿主细胞基因组中并传至后代细胞能稳定地整合到宿主细胞基因组中并传至后代细胞3.3.有广泛的宿主范围，对宿主细胞无毒性；有广泛的宿主范围，对宿主细胞无毒性；4.4.载体容量较大，可插入载体容量较大，可插入7 78 8个个kbkb的外源基因片段，的外
29、源基因片段，其转化途径多是单一座位单拷贝，并在整合位点附其转化途径多是单一座位单拷贝，并在整合位点附 近不发生明显的重排；近不发生明显的重排；5.5.不需要显微注射器，操作简单。不需要显微注射器，操作简单。逆转录病毒载体技术缺点：逆转录病毒载体技术缺点：1.1.整合率较低，不易用于受精卵，而多用于整合率较低，不易用于受精卵，而多用于 感染早期胚胎和早期胚胎干细胞。感染早期胚胎和早期胚胎干细胞。2.2.由由于于胚胚胎胎是是多多细细胞胞的的，整整合合又又是是随随机机的的，每每个个细细胞胞的的整整合合位位置置和和数数目目不不同同，表表达达程程度度不不一一样样，因因此此只只能能形形成成嵌嵌合合体体，不
30、不能能直直接接得得到到转基因动物。转基因动物。（3 3）精子载体技术）精子载体技术 19891989年年LavitranoLavitrano等等首首先先报报道道了了用用精精子子作作为为载载体体，通通过过受受精精作作用用将将外外源源基基因因引引进进受受精精卵卵这这一一方方法法用用小小鼠鼠附附睾睾内内的的精精子子作作为为载载体体，将将DNADNA分分子子导导入入卵卵细细胞胞，获获得得了了转转基基因因小小鼠鼠。据据报报道道有有30%30%的的小小鼠鼠获获得得了了外外源源基基因因的的整整合合，并并建立了转基因鼠系。建立了转基因鼠系。BrinsterBrinster等等(1989):(1989):实验方
31、法完全与实验方法完全与LavitranoLavitrano的相同的相同.得到得到13001300小小鼠鼠,经检测无一只为转基因小鼠经检测无一只为转基因小鼠.1998 Maione1998 Maione等用小鼠精子与等用小鼠精子与PSV2CATPSV2CAT共孵育共孵育 共共7575组组 出生小鼠出生小鼠 转基因小鼠转基因小鼠 转基因效率转基因效率 1755 1755只只 130 130只只 7.4%7.4%其中其中1313组组 366 366只只 130 130只只 36%36%其中其中5 5组组 85%85%其中其中3 3组组 100%100%其余其余6262组组 1389 1389只只 0
32、 0 0 0精子与精子与DNADNA结合的调控机制结合的调控机制 Lavitrano等等(1989)(1989)与与HoranHoran等等(1991)(1991)发发现现:只只有有活活精精子子才才可可以以吸吸收收DNA,DNA,死死精精子子没没有有这这种种能能力力。这这似似乎表明精子与乎表明精子与DNADNA的相互作用与精子的代谢有关。的相互作用与精子的代谢有关。用用甲甲醛醛固固定定精精子子,破破坏坏精精子子头头部部蛋蛋白白,发发现现精精子子不不能能吸吸收收DNA,DNA,说说明明精精子子吸吸收收DNADNA与与其其头头部部蛋蛋白白有有关关,是一种生理生化反应而不是一般的物理过程。是一种生理
33、生化反应而不是一般的物理过程。CamaioniCamaioni等等(1992)(1992)对精子吸附对精子吸附DNADNA的的定位研究表明定位研究表明:DNA:DNA的主要作用部位是精子的主要作用部位是精子头部的赤道段和顶体后区头部的赤道段和顶体后区.说明说明30-35KD30-35KD蛋蛋白分布于这两个区域白分布于这两个区域.(4)Embryonic stem cell technology 胚胚胎胎干干细细胞胞（ESES细细胞胞）是是从从着着床床前前的的动动物物胚胚胎胎中中分分离离获获得得的的一一种种多多功功能能胚胚胎胎干干细细胞胞。把把胚胚胎胎干干细细胞胞注注射射到到动动物物囊囊胚胚后后
34、，可可参参与与受受体体胚胚胎胎的的构构成成，形形成成嵌嵌合合体体，再再通过繁殖，获得通过繁殖，获得ESES细胞后代。细胞后代。胚胎干细胞技术优点：胚胎干细胞技术优点：外源基因整合情况的可控性高。外源基因整合情况的可控性高。可可预预先先在在细细胞胞水水平平检检测测外外源源基基因因的的拷拷贝贝数数、定定位、表达的水平及插入的稳定性。位、表达的水平及插入的稳定性。外外源源基基因因导导入入ESES细细胞胞的的方方法法多多样样，细细胞胞鉴鉴定定及及筛选方便。筛选方便。ESES细胞系建立及培养困难细胞系建立及培养困难维持维持ESES细胞的未分化及多向分化潜能不易细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌
35、合体所得个体为嵌合体 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。比较成熟，在大动物上应用较晚。胚胎干细胞技术胚胎干细胞技术缺点缺点：胚胎干细胞分为三大类ECESEG或 PGCsES cells growing in culture（二）转基因动物的构建方法（二）转基因动物的构建方法转基因动物的构建方法包括转基因动物的构建方法包括:显微注射法显微注射法逆转录病毒法逆转录病毒法胚胎干细胞法胚胎干细胞法精子载体法精子载体法 小鼠小鼠ESES细胞技术细胞技术 ESES细细胞胞即即早早期期胚胚胎胎干干细细胞胞(embryonic(embryonic
36、 stem stem cell)cell)。通通过过ES ES 细细胞胞获获得得转转基基因因动动物物的的方方法法，在在发发育育生生物物学学、遗遗传传学学、医医学学等等学学科科具具有有广广泛泛的的应应用。用。ESES细胞的基因操作细胞的基因操作 ESES细细胞胞系系建建成成后后，人人们们考考虑虑用用ESES细细胞胞作作基基因因操操作作。因因为为ESES细细胞胞在在严严格格的的生生长长条条件件下下可可以以长长期期稳稳定定的的以以细细胞胞系系形形式式维维持持生生长长。所所以以，可可以以象象普普通通体体细细胞胞那那样样，通通过过各各种种手手段段如如磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀法法，逆逆转转录录病病毒毒感感染染
37、或或电电穿穿孔孔等等方方法法进进行行基基因因转转化化、筛筛选选和和克克隆隆，由由于于ESES细细胞胞能能够够进进行行体体外外培培养养，所所以做基因操作就比较容易。以做基因操作就比较容易。实现基因的定位整合实现基因的定位整合在在细细胞胞内内具具有有相相似似的的核核苷苷酸酸顺顺序序的的DNA DNA 片片段段之之间间，可可以以相相互互配配对对并并且且发发生生交交换换，称称为为DNADNA的的同同源源重重组组（Homologous recombinationHomologous recombination）。）。将将细细胞胞基基因因组组的的某某一一序序列列克克隆隆并并加加以以改改造造后后，重重新新导
38、导入入细细胞胞中中，这这一一序序列列就就可可以以与与基基因因组组内内的的同同源源序序列列发发生生重重组组，从从而而将将改改造造后后的的基基因因置置换换到到基基因因组组内内，实实现现基基因因的的定定位位突突变变，这这一一技技术术被被形形象象地称为地称为“基因打靶基因打靶”（Gene targetingGene targeting）。）。1 1、基因打靶技术、基因打靶技术 基基因因打打靶靶技技术术是是一一种种定定向向改改变变生生物物活活体体遗遗传传信信息息的的实实验验手手段段。通通过过对对生生物物活活体体遗遗传传信信息息的的定定向向修修饰饰（基基因因灭灭活活、点点突突变变引引入入、缺缺失失突突变变
39、、外外源源基基因因引引入入、染染色色体体组组大大片片段段删删除除等等），并并使使修修饰饰后后的的遗遗传传信信息息在在生生物物活活体体内内遗遗传传，表表达达突突变变的的性性状状，从从而而研研究究基基因因功功能能等等生生命命科科学学的的重重大大问问题题，以以及及提提供供相相关关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。的疾病治疗、新药筛选评价模型等。2 2、定位整合载体的构建、定位整合载体的构建 定位整合载体的组成：定位整合载体的组成：质粒骨架质粒骨架 筛选基因（标记基因）筛选基因（标记基因）同源序列同源序列 定位突变的质粒载体又称靶载体（定位突变的质粒载体又称靶载体（Targeting Targeting
40、 vectorvector），构建靶载体的目的是要在目的基因的），构建靶载体的目的是要在目的基因的一个外显子中造成突变。一个外显子中造成突变。1 1、用置换型载体还是用插入型载体？、用置换型载体还是用插入型载体？2 2、打靶载体中带有多长的同源序列？、打靶载体中带有多长的同源序列？3 3、用同系的、用同系的DNADNA还是用非同系的还是用非同系的DNADNA构建打构建打 靶载体？靶载体？4 4、用筛选方法还是用富集方法获得中靶的、用筛选方法还是用富集方法获得中靶的 ESES细胞？细胞？构建一个打靶载体要考虑几个问题构建一个打靶载体要考虑几个问题置换型载体置换型载体 置置换换型型载载体体，其其基
41、基本本元元件件是是与与靶靶位位点点两两侧侧同同源源的的同同源源序序列列臂臂、正正筛筛选选标标记记基基因因、质质粒粒序序列列、同同源臂外侧的线性化位点源臂外侧的线性化位点。重重组组的的结结果果是是：载载体体中中的的同同源源序序列列与与靶靶基基因因间间发发生生两两次次交交换换，靶靶基基因因序序列列被被把把载载体体上上同同源源臂臂与与同同源源臂臂间间的的序序列列所所代代替替，而而载载体体末末端端的的非非同同源源序序列被切除。列被切除。G418neoneo打靶载体打靶载体xx打靶后的基因打靶后的基因打靶基因打靶基因置换型重组置换型重组插入型载体插入型载体插插入入型型载载体体又又称称O O型型载载体体，
42、在在打打靶靶过过程程中中，整整个个载载体体序序列列通通过过同同源源重重组组插插入入到到基基因因组组序序列列中中，使使靶靶基基因因产生突变。产生突变。插插入入型型载载体体的的基基本本结结构构元元件件与与置置换换型型载载体体类类似似。但但它它的的线线性性化化位位点点在在同同源源序序列列内内部部，靶靶载载体体与与靶靶位位点点之之间间经经过过1 1次次交交换换将将载载体体插插入入到到靶靶基基因因组组序序列列中中，从从而使同源序列而使同源序列“复制复制”了了1 1倍。倍。插入型载体与置换型载体相比打靶效率高5-10倍，但由于插入型载体在打靶时有许多拓扑构型，因此人们更倾向于使用置换型载体。筛选基因（标记
43、基因）筛选基因（标记基因）正筛选基因正筛选基因：转化子存活，非转化子死亡：转化子存活，非转化子死亡 neo-G418（与新霉素相关的氨基糖苷）这种选（与新霉素相关的氨基糖苷）这种选 择系统适用于所有细胞类型择系统适用于所有细胞类型负筛选基因负筛选基因：定位转化子存活，随机转化死亡定位转化子存活，随机转化死亡 HSV-tk GANC 或或 FIAU（病毒的胸腺嘧啶激酶基因）（病毒的胸腺嘧啶激酶基因）(毒性核苷酸类似物）毒性核苷酸类似物）双向选择基因：双向选择基因：用于用于Hprt (次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的ES细胞细胞 Hprt+细胞在细胞在HAT培养基中
44、存活培养基中存活 Hprt 细胞在细胞在6-TG培养基中存活培养基中存活 正筛选基因的方法通常是插入一个能够正筛选基因的方法通常是插入一个能够在在ESES细胞中表达的细胞中表达的neoneo基因（新霉素抗性基基因（新霉素抗性基因）。这样不但在基因中造成了插入突变，因）。这样不但在基因中造成了插入突变，而且可以利用筛选培养基而且可以利用筛选培养基G418G418来筛选转化细来筛选转化细胞，检测是否存在选择标记基因，判定打靶胞，检测是否存在选择标记基因，判定打靶载体是否整合到基因组中。载体是否整合到基因组中。负筛选基因负筛选基因 一般选择一般选择HSV-tk HSV-tk 基因作为负筛选基因，这样
45、可以在基因作为负筛选基因，这样可以在正选择标记筛选的基础上再富集同源重组克隆正选择标记筛选的基础上再富集同源重组克隆3 35 5倍。倍。neo12lacZtk3IREs正负选择载体的基本结构正负选择载体的基本结构 正负双向选择载体正负双向选择载体3、细胞的转化、细胞的转化 得得到到构构建建的的靶靶载载体体后后，即即可可以以进进行行ESES细细胞胞的的转染。用前要用转染。用前要用BstE IIBstE II酶将靶载体线性化。酶将靶载体线性化。把把外外源源目目的的基基因因和和具具有有标标记记neoneo基基因因的的重重组组的的病病毒毒载载体体，用用适适当当的的方方法法使使这这个个重重组组体体转转化
46、化ESES细细胞胞。然然后后，把把这这些些ESES细细胞胞培培养养在在具具有有G418G418的的培培养养基基中中，经经过过一一段段时时间间，未未被被转转化化的的ESES细细胞胞，因因无无neoneo基基因因，都都被被G418G418杀杀死死，留留下下来来的的都都是是被被导导入入neoneo基基因因的的ESES细细胞胞。当当然然这这些些转转化化细细胞胞也也具具有有外源目的基因了。外源目的基因了。4、定位整合的检测、定位整合的检测 （1 1）Southern Southern 印迹法印迹法 基基因因发发生生突突变变后后，其其限限制制性性内内切切酶酶片片段段长长度度将将有有所所改改变变，因因此此用
47、用特特定定限限制制性性内内切切酶酶消消化化ESES细细胞胞的的基基因因组组DNADNA，进进行行SouthernSouthern印印迹迹杂杂交交分分析析，可可以以通通过过比比较较杂杂交交片片段段长长度度的的变变化化判判断断定定位位整整合合事事件的有无。件的有无。（2 2）PCR PCR 法法 聚合酶链式反应法也可以检出定位转化子。聚合酶链式反应法也可以检出定位转化子。（三）具有遗传标记的（三）具有遗传标记的ES细胞嵌细胞嵌 合体建立及转基因小鼠的获得合体建立及转基因小鼠的获得 把把上上述述转转化化的的ESES细细胞胞通通过过显显微微注注射射，注注入入宿宿主主囊囊胚胚的的囊囊胚胚腔腔中中，并并参
48、参与与宿宿主主囊囊胚胚内内细细胞胞团团的的发发育育，在在假假母母子子宫宫内内形形成成嵌嵌合合体体胎胎儿儿。出出生生后后的的嵌嵌合合体体，经经杂杂交交可可获获得得种种系系嵌嵌合合体体即即转转目目的的基基因因小小鼠鼠。（以以毛毛色标记为例）色标记为例）blastocystsInjection of EScells into blastocystsSuccessfully transformed ES cells are injected into blastocystsRetrieval of BlastocystsLittermatesBlack mouse-no apparent ES cell contributionChimeric founder-strong ES cellcontributionChimeric founder-weaker ES cellcontribution