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1、转基因动物制备技术 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life, there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望6.1 6.1 转基因与转基因动物转基因与转基因动物转基因：转基因：1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。2）转基因技术就是指利用分子生物学技术，）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因
2、转移到其它物种中，改造生将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。标转变。转基因动物转基因动物是指那些在其所有体细胞基因组内稳定整是指那些在其所有体细胞基因组内稳定整合着以实验方法导入的外源合着以实验方法导入的外源DNA的一类动的一类动物，这类动物由于外源遗传物质的稳定存物，这类动物由于外源遗传物质的稳定存在而被赋予某种新的表型。这种表型可通在而被赋予某种新的表型。这种表型可通过携带外源遗传物质的生殖细胞而传递给过携带外源遗传物质
3、的生殖细胞而传递给子代动物个体。子代动物个体。1 1、DNADNA显微注射法：显微注射法：将将DNADNA注射到胚胎的细胞核内，再注射到胚胎的细胞核内，再把注射过把注射过DNADNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。的幼仔。 2 2逆转录病毒感染法：逆转录病毒感染法：利用逆转录载体将遗传信息以利用逆转录载体将遗传信息以RNARNA分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。因组中去，最
4、终得到转基因小鼠。3 3胚胎干细胞法：胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系胚腔，参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体目的基因的个体显微注射法建立转基因鼠显微注射法建立转基因鼠技术路线技术路线 1. 显微注射显微注射DNA的制备与纯化的制备与纯化 2. 鼠的种类、安置与饲养鼠的种类、安置与饲养 3. 超排卵与取卵超排卵与取卵 4. 显微注射显微注射 5. 卵的转移卵的转移 6. 转基因鼠系的建立转基因鼠系
5、的建立实验程序实验程序： 显微注射显微注射DNA的制备与纯化的制备与纯化1）酶解、分离与抽提）酶解、分离与抽提2）氯化铯离心）氯化铯离心3）收集）收集DNA溶液溶液4）透析与定量）透析与定量 2. 2.鼠的种类、安置与饲养鼠的种类、安置与饲养3.3.超排卵与取卵超排卵与取卵 1）超排卵：）超排卵：46周母鼠在明暗循环的动物房内饲养周母鼠在明暗循环的动物房内饲养35天，天，即可作超排卵。用孕马血清（即可作超排卵。用孕马血清（PMS）模拟卵泡模拟卵泡刺激素（刺激素（FSH）的作用，用人绒毛膜促性腺激的作用，用人绒毛膜促性腺激素（素（hCG）模拟黄体生成素（模拟黄体生成素（LH）的作用。的作用。影响
6、鼠超排卵的因素有：母鼠的种系、周龄与影响鼠超排卵的因素有：母鼠的种系、周龄与体重，激素应用剂量与注射时间。卵能否受精体重，激素应用剂量与注射时间。卵能否受精则取决于公鼠的生殖能力。则取决于公鼠的生殖能力。2）取卵：）取卵：4. 显微注射显微注射 1）制备持卵管与注射针）制备持卵管与注射针持卵管的作用是连接负持卵管的作用是连接负压装置可吸住卵以利注压装置可吸住卵以利注射，注射针是吸入射，注射针是吸入DNA溶液后连接注射器或压溶液后连接注射器或压力泵将力泵将DNA注射入受精注射入受精卵内，二者均可由卵内，二者均可由1毫米毫米口径的微玻璃管拉制而口径的微玻璃管拉制而成。成。 2）显微注射操作）显微注
7、射操作倒置显微镜可配倒置显微镜可配用培替培养皿作用培替培养皿作注射槽，滴注射槽，滴1大滴大滴M2培养液在培养培养液在培养皿中心，上面覆皿中心，上面覆盖矿物油。盖矿物油。5. 卵的转移卵的转移1）输卵管移卵）输卵管移卵2）子宫移卵）子宫移卵6.6.转基因鼠系的建立转基因鼠系的建立 假孕母鼠产出幼仔后，可用幼鼠尾巴提取假孕母鼠产出幼仔后，可用幼鼠尾巴提取DNADNA，对于一些基因调控研究，需要尽快获得对于一些基因调控研究，需要尽快获得信息而暂不需保留转基因鼠，亦可取鼠胚胎信息而暂不需保留转基因鼠，亦可取鼠胚胎提取提取DNADNA。 从胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的从胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的DNADNA，
8、可用可用PCRPCR、Dot blotDot blot（斑点杂交）、斑点杂交）、Southern Southern blotblot等多种方法分析以确定是否为转基因鼠等多种方法分析以确定是否为转基因鼠用途用途1. 转基因动物生物反应器：转基因动物生物反应器：生物反应器是指利用转基因活体动物的生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。健蛋白。生物反应器的种类及应用生物反应器的种类及应用上海医学遗
9、传所转凝血上海医学遗传所转凝血因子基因羊技术路线：因子基因羊技术路线：2.2.实验动物模型：实验动物模型：研究目的基因在体内表达的调控机研究目的基因在体内表达的调控机制、在动物个体生长发育中的作制、在动物个体生长发育中的作用，以及某些疾病相关基因改变导用，以及某些疾病相关基因改变导致疾病病理表型的分子机制。致疾病病理表型的分子机制。6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术基因敲除（基因敲除（gene knock out）:应用此技术培育的应用此技术培育的基因靶向性敲除小鼠基因靶向性敲除小鼠是研究是研究小鼠胚胎生成和行为的有力实验系统，也是研小鼠胚胎生成和行为的有力实验系统，也是研究人类遗传基因
10、病的有用模型。究人类遗传基因病的有用模型。 将某基因突变的位点通过同源重组引入将某基因突变的位点通过同源重组引入小鼠小鼠ESES细胞。细胞。 将含有敲除基因突变位点的将含有敲除基因突变位点的ESES细胞注入细胞注入小鼠早期胚胎细胞，孕育出嵌合小鼠。小鼠早期胚胎细胞，孕育出嵌合小鼠。 嵌合小鼠交配后确定其生殖细胞内是否嵌合小鼠交配后确定其生殖细胞内是否整合有突变的基因位点。整合有突变的基因位点。 在各只敲除突变基因位点杂合性小鼠之在各只敲除突变基因位点杂合性小鼠之间交配产生纯合性基因敲除小鼠。间交配产生纯合性基因敲除小鼠。培育基因靶向性敲除小鼠的主要步骤：培育基因靶向性敲除小鼠的主要步骤：Man
11、sur的正负选择系统：的正负选择系统：构建含有一段与靶基因同源顺序的载体，该同源顺序的构建含有一段与靶基因同源顺序的载体，该同源顺序的1个外显子内插有新霉素抗性基因（个外显子内插有新霉素抗性基因（NEO）作为正选择的标作为正选择的标志，在同源顺序的志，在同源顺序的3端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（激酶（HSV-tk）基因的顺序作为负选择，基因的顺序作为负选择，HSV-tk基因由基因由邻近的邻近的NEO基因启动子调节。基因启动子调节。用电转移（用电转移（Electroporation）法将重组体导入胚法将重组体导入胚胎干细胞，继续作体外培养，并以胎干细胞，继续作
12、体外培养，并以G418和和GANC作双重筛选。因随机插入的作双重筛选。因随机插入的DNA通常从通常从头至尾整合入受体细胞头至尾整合入受体细胞DNA中，中，HSV-tk+基因产基因产物可使物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡转变成一种有毒物质使细胞死亡。如果发生同源重组，由于。如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之基因在同源区之外不能整合，外不能整合，neor基因在同源区之内得以保留，基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗这样受体细胞抗G418有正选择作用，对有正选择作用，对GANC无转变功能而没有负选择作用，因此认为存活无转变功能而没有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组。的细胞是与导入基因发生同源重组。存在的问题：存在的问题： 如被敲除的是具有致命功能的基因，则小鼠将在如被敲除的是具有致命功能的基因，则小鼠将在胚胎早期死亡，如发生致命的出血。胚胎早期死亡，如发生致命的出血。 在长大的基因敲除小鼠体内内，各基因功能往在长大的基因敲除小鼠体内内，各基因功能往往组成网络，互相交织，某些基因具有多种功能。往组成网络，互相交织，某些基因具有多种功能。 被敲除基因的功能可以被其他基因的功能代偿，被敲除基因的功能可以被其他基因的功能代偿，使其表型的改变模糊而难以分析。使其表型的改变模糊而难以分析。