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1、实验二细菌基因组DNA的提取 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望l分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。l核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子；核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。排除其它
2、核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则l核酸制备时应注意的事项核酸制备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取时间。尽量简化操作步骤，缩短提取时间。减少化学因素对核酸的降解。减少化学因素对核酸的降解。减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。l核酸制备的步骤：核酸制备的步骤：破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞提取提取提取提取纯化纯化纯化纯化l核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好
3、。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。3、核酸制备的一般方法和原理、核酸制备的一般方法和原理DNase抑制 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。RNase抑制 操作要带手套。所有器皿要严格消毒，试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。l核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白
4、质。用于核酸核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2 2溶解核小体上的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；溶解核小体上的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3 3对对RNaseRNase、DNaseDNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDSSDS、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、4-4-氨基水杨酸钠、萘氨基水杨酸钠、萘-1.5-1.5-二磺酸钠、二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠三异丙基萘磺酸钠l核酸制备中常用的蛋白质
5、变性剂核酸制备中常用的蛋白质变性剂 1.1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。2.2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制RNaseRNase活性和破裂细胞的作用。活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPCDEPCl核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 DNaseDNase RNase RNase 蛋白酶蛋白酶K K 溶菌酶溶菌酶 细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去
6、蛋白质 沉淀核酸沉淀核酸核核酸酸提提取取的的一一般般过过程程细胞破碎细胞破碎 机械方法：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用化学试剂法：用SDS处理细胞；处理细胞；酶解法：酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。DNA提取提取 SDS（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠）法）法：SDS是有效的阴离子去垢剂是有效的阴离子去垢剂,细胞中细胞中DNA与与蛋白质之间蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。能够破坏这种价键。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵（十六烷基三甲基溴化铵）法）法
7、：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使性，使DNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。DNA纯化（去杂质）纯化（去杂质）蛋白质：蛋白质：常用苯酚：氯仿：异戊醇（常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。）抽提。RNA：常选用：常选用RNase消化消化，或是用，或是用LiCl来消除大分子的来消除大分子的RNA。酚类物质：酚类物质：提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材
8、料。多糖：多糖：提取液中加提取液中加1PVP。核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程核酸样品的保存核酸样品的保存温度：44（55）最佳和最简单）最佳和最简单 -70 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20 -20保存保存保存介质：TETE缓冲溶液缓冲溶液(最常用最常用)10mmol/L Tris-Cl pH8.0 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0二、材料、设备及试剂二、材料、设备及试剂 菌种菌种 ：大肠杆菌：大肠杆菌设备设备 ：eppendorfeppendorf管
9、、微量取液器管、微量取液器(20l,200l,1000l)(20l,200l,1000l)，台式高速离心机，台式高速离心机，涡旋振荡器，水浴锅（涡旋振荡器，水浴锅（37、60 ）试剂：试剂：LBLB液体培养基液体培养基 、RNARNA酶酶A A、无水乙醇、无水乙醇无菌水（或无菌水（或TE）缓冲液、）缓冲液、10%的的SDS、20mg/ml的蛋白酶的蛋白酶K，、，、5mol/L NaCl、酚：氯仿：异戊醇、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、）、异丙异丙醇、醇、75%乙醇、乙醇、CTAB/NaCl溶液溶液(CTAB:5gCTAB溶于溶于100ml0.5molNaCl中，加中，加热到热到65度溶解
10、。）度溶解。）1、培养、培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取的细菌培养物至饱和状态，取1.2ml的培养物离心的培养物离心12000rpm,1min。2、沉淀物加入、沉淀物加入570ul的无菌水（或的无菌水（或TE）缓冲液，用吸管反复吹打使之重）缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入悬。加入30ul 10%的的SDS和和10ul 20mg/ml的蛋白酶的蛋白酶K，混匀，于，混匀，于37温育温育1h，（加入，（加入3ul的溶菌酶的溶菌酶50mg/ml效果更好）。效果更好）。3、加入、加入100ul 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，溶液，混匀，
11、于混匀，于60 温育温育10min。(上下颠倒混匀上下颠倒混匀)，离心，离心，12000rpm,5min。4、取上清，加入等体积（约、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，离心，混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提，将上清液转至新管中。（抽提两次）两次）5、加入、加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止沉淀下来，静止10分钟，离分钟，离心心,12000rpm,10min。6、沉淀用、沉淀用1ml的的75%乙醇中洗涤，离心乙醇中洗涤，离心5min，弃上清液，重悬于，弃上清
12、液，重悬于30ul的的无菌水（或无菌水（或TE）缓冲液。）缓冲液。三、操作步骤三、操作步骤四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项材料准备材料准备材料准备材料准备最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致材料应适量，过多会影响裂解，导致DNADNA量量少，纯度低少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研
13、磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项核酸分离、纯化核酸分离、纯化核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNADNA时，应提时，应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相针对不同材料的特点，在提
14、取过程中辅以相应的去杂质的方法应的去杂质的方法四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/101/10体积的体积的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M），有利），有利于充分沉淀于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用7070的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNADNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TETE缓冲液溶解缓冲液溶解TETE中的中的EDTAEDTA能螯和能螯和MgMg2+2+或或MnMn2+2+离子，抑制离子，抑制DNaseDNasepHpH值为值为8.08.0，可防止，可防止DNADNA发生酸解发生酸解