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1、第四章 工具酶及应用1第1页，本讲稿共31页TOOLS FOR GENE CLONINGSCISSORS:RESTRICTION ENZYMES GLUE:DNA LIGASE VEHICLE:PLASMID OR VIRAL VECTORS2第2页，本讲稿共31页 基因工程的工具酶定义 用于DNA和RNA切割和连 接的各种酶叫做工具酶。3第3页，本讲稿共31页第一节 限制性核酸内切酶限制酶的生物学功能 是细菌细胞抵抗外源入侵DNA的 防御工具 提供细菌种属和细菌株间交叉繁殖 的屏障4第4页，本讲稿共31页限制性核酸内切酶的分类目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可分为三大类。类限制性核酸
2、内切酶广泛用于基因工程；特点：识别切割位点比较专一，只有切割作用。类和类限制性核酸内切酶同时具有内切活性和甲基化修饰活性，不适用于基因工程。5第5页，本讲稿共31页一.限制性内切酶的命名Hind H in d 细菌属名的第一个字母细菌种名的前两个字母细菌菌株的第一个字母同一菌株中发现的第三种酶6第6页，本讲稿共31页EcoRI E co R I细菌属名的第一个字母细菌种名的前两个字母该酶的基因位于R质粒上该菌株发现的第一种内切酶7第7页，本讲稿共31页8第8页，本讲稿共31页二.II型限制酶的识别特点识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固定位置切割，识别顺序为回文结构。客 上 天 然 居居 然
3、天 上 客9第9页，本讲稿共31页EcoRI PstI HpaI 533-G ACGTC-CTGCA G-553-G AATTC-53-CTTAA G-5533-GTT AAC-CAA TTG-5 sticky end 5粘末端3 sticky end 3粘末端blunt end 平末端 三.限制性内切酶的切割方式10第10页，本讲稿共31页四.识别位点与切割方式同尾酶：两种酶识别不同的顺序，但切割产生的粘末端相同，叫做同尾酶。同尾酶产生的粘末端，可通过碱基互补连接，形成的位点称为“杂种位点”，该位点不能再被原来的两种酶切割。11第11页，本讲稿共31页例：AGATCT GGATCC TCTA
4、GA CCTAGGBgl BamH ATCTAGGATCC G连接酶AGATCCTCTAGG12第12页，本讲稿共31页同位酶:识别相同的序列,但切割位点不同.同裂酶:来源不同,但识别位点和切割位点相同.13第13页，本讲稿共31页五.限制性内切酶的反应条件 反应温度 一般为37oC反应体积20lDNA含量 0.51g酶含量 12uDNA纯度：OD260/280nm1.7 阳离子 Mg2+反应时间 1-1.5hpH7.514第14页，本讲稿共31页限制性核酸内切酶的反应条件各种限制性核酸内切酶反应条件相似，主要区别是对盐浓度的需求不同。据此可分为三组低盐组 050mmol/L NaCl中盐组
5、50100mmol/L NaCl高盐组 100150mmol/L NaCl15第15页，本讲稿共31页限制性核酸内切酶的星号活性 当酶切条件发生变化时，限制性核酸内切酶的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称作限制性核酸内切酶的星号活性。16第16页，本讲稿共31页例如 EcoR I在正常条件下识别GAATTC,但在低盐（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、甘油大量存在时，识别序列增加了AAATTC、GAGTTC,导致EcoR I在DNA分子上的切割位点大大增加。17第17页，本讲稿共31页第二节 其他工具酶一.DNA聚合酶作用:依据模版,连接游离的单核苷酸,形成与 模版互
6、补的新链。18第18页，本讲稿共31页1.大肠杆菌DNA聚合酶该酶具有三种酶活性 53 DNA聚合活性 35 外切酶活性 识别切除错配的核苷酸 53 DNA外切酶活性19第19页，本讲稿共31页5CCGATA-OH 33GGCTATCGGA 5CCGATAGCCT 33GGCTATCGGA53 DNA聚合酶活性DNA聚合酶dNTP20第20页，本讲稿共31页5CCGATA-OH 33GGC DNA聚合酶5CCG3GGC dA,dT35 外切酶活性21第21页，本讲稿共31页2.大肠杆菌DNA聚合酶大片段 该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶，从全酶中切去 5 3 外切活性的
7、肽段后产生的一条多肽链，保留了53聚合和35外切活性。该酶称为Klenow酶。也称为 Klenow 片段（Klenow fragment）。22第22页，本讲稿共31页3.T4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有 53 DNA聚合酶活性35 外切酶活性23第23页，本讲稿共31页4.TaqDNA聚合酶 耐热的 DNA聚合酶。最适反应温度7580oC，主要用于聚合酶链反应。24第24页，本讲稿共31页5.逆转录酶（reverse transcriptase）作用：以RNA为模版，合成 cDNA (Complementary DNA)该类酶有三种活性 RNA依赖的DNA聚合酶活性
8、 DNA依赖的DNA聚合酶活性 外切RNA的活性 25第25页，本讲稿共31页常用的逆转录酶有两种：AMV来自于鸟类骨髓母细胞瘤病毒 M-MLV来自于莫络尼鼠的白血病病毒26第26页，本讲稿共31页 二.T4DNA连接酶催化两个两个DNA片段片段的3-OH和5-P末端 形成磷酸二酯键该酶是大肠杆菌T4噬菌体的DNA30编码的产物，分子量68kd。现已由基因工程菌表达。27第27页，本讲稿共31页DNA连接酶连接酶连接的部位：连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。不是氢键（梯子的踏板）。28第28页，本讲稿共31页降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA的实验中谨防RNA酶污染。三.RNA酶29第29页，本讲稿共31页四.核酸酶SI降解单链 DNA 或 RNA，形成5-P的单核苷酸或寡核苷酸片段对DNA的活性比对RNA的强产生平末端30第30页，本讲稿共31页五.碱性磷酸酶切除DNA或RNA的5-P防止DNA自身环化5 p TTAGCTAGGCCC TCAATCGGTACG OH 33 HO-AATCGATCCGGG AGTTAGCCATGCp 531第31页，本讲稿共31页