《临床样本的采集、运输和保存及核酸提取.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床样本的采集、运输和保存及核酸提取.ppt（67页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、临床标本的采集、处理、运送与临床标本的采集、处理、运送与保存及保存及DNA/RNADNA/RNA提取提取 研究背景研究背景l 样本的采集、处理样本的采集、处理l 样本的保存样本的保存l 样本的运输样本的运输l DNADNA的提取的提取l RNARNA的提取的提取研究背景研究背景一、样本的采集、处一、样本的采集、处 理、保存及运输理、保存及运输临床标本的正确采集、运送、保存临床标本的正确采集、运送、保存的重要性的重要性l临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节l解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一（一）、样本的采集（一）、样本的采集地贫检测
2、样品采集：地贫检测样品采集：l 外周血外周血:5mLl 脐带血脐带血:0.51mLl 羊羊 水：水：2030mLl 绒绒 毛：毛：15mgl 唾唾 液液l 组组 织织标本采集的注意事项标本采集的注意事项l所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下进行下进行l已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送l采集采集足够量标本足够量标本l每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时间及相关临床信息日期、时间及相关临
3、床信息全全 血血l以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用的选择，一般使用EDTA-NaEDTA-Na2 2或枸椽酸钠，不或枸椽酸钠，不可使用肝素可使用肝素l全血样本如用于全血样本如用于DNADNA提取检测，可提取检测，可44下短下短期保存期保存,如用于如用于RNARNA检测，则应在取血后，检测，则应在取血后，尽快提取尽快提取RNARNA血清（浆）血清（浆）lDNADNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大对测定影响不大lRNARNA测定，标本的获取和保存方式对测定结测定，标本的获取和保存方式对测
4、定结果，可能有决定性影响。最好是使用果，可能有决定性影响。最好是使用EDTAEDTA抗凝抗凝(严禁使用肝素严禁使用肝素)全血标本，抗凝后全血标本，抗凝后6 6小小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快快(2(2小时内小时内)分离血清，标本的短期（分离血清，标本的短期（1 12 2周）保存可在周）保存可在-20-20下，较长期保存应在下，较长期保存应在-7070下下 肝素的作用机理肝素的作用机理l肝素对肝素对MLV逆转录酶和逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在
5、核酸纯化过程中，程中，标本中的肝素可结合于标本中的肝素可结合于DNA和和RNA上上l对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用l每每g核酸标本中加入核酸标本中加入0.1U的肝素，即可的肝素，即可100%的抑制的抑制酶活性酶活性l在标本中加入肝素酶在标本中加入肝素酶I 或或13 U/g核酸在于核酸在于5 mM Tris pH7.5,1 mM CaCl2,40 U RNasin 25 下作用下作用2小时可去除肝素的抑制作用小时可去除肝素的抑制作用（二）、样本的运送（
6、二）、样本的运送l样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室l样本中如加入了适当的稳定剂，如用于样本中如加入了适当的稳定剂，如用于DNADNA测定的测定的EDTAEDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄l建议：将全血标本或建议：将全血标本或DNADNA样本用冰袋加泡沫盒快递样本用冰袋加泡沫盒快递运送。如需提取运送。如需提取RNARNA的样本需预处理后加的样本需预处理后加lmllml TrizolTrizol在低温运送在低温运送（三）、样本的保存（三）、样本的保存l常规外周血标本，采集后做血常规，常温常规外周血标本，采集后
7、做血常规，常温24小时内，小时内，4可保存可保存1周；做血红蛋白电泳常温周；做血红蛋白电泳常温1周，电泳周，电泳4可保存可保存15天；天；DNA提取样本常温提取样本常温24小时，小时，4保存保存1个星期，个星期，20 保存保存3个月，个月，70 保存半年保存半年3年；年；RNA提取样本常提取样本常温温6小时，小时，4保存保存12小时，小时，70 保存保存3个月，羊水在个月，羊水在12小时内离心可保存同上。小时内离心可保存同上。研究背景研究背景 二、核酸的提取二、核酸的提取核酸提取的重要性核酸提取的重要性l核酸提取是临床核酸提取是临床PCRPCR检验最为关键的部分，检验最为关键的部分，亦是手式操
8、作的主要部分亦是手式操作的主要部分l核酸提取的成败关系到临床核酸提取的成败关系到临床PCRPCR检验的正确检验的正确与否与否l临床临床PCRPCR检验操作中最易出问题的环节检验操作中最易出问题的环节（一）、提取核酸总的原则（一）、提取核酸总的原则l保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；l其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应分子的污染应降低到最低程度；降低到最低程度；l核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；l其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取
9、DNADNA中的中的RNARNA，也应尽量去除也应尽量去除。（二）、核酸提取的基本步骤（二）、核酸提取的基本步骤1、核酸的释放：核酸的释放：破裂细胞破裂细胞破裂细胞破裂细胞 释放核酸释放核酸释放核酸释放核酸 机械法与非机械法机械法与非机械法机械法与非机械法机械法与非机械法 （非机械法中（非机械法中（非机械法中（非机械法中溶胞法溶胞法溶胞法溶胞法是应最广泛的方法）是应最广泛的方法）是应最广泛的方法）是应最广泛的方法）各种组织细胞破碎方法各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法 应用应用 机械法机械法1.1.匀浆法匀浆法机体软组织机体软组织2.2.捣碎法捣碎法动物韧性组织动物韧性组织3.3.研
10、磨法研磨法细菌、酵母细菌、酵母 物理法物理法1.1.超声法超声法细胞混悬液细胞混悬液2.2.反复冻融法反复冻融法培养细胞培养细胞3.3.冷热交替法冷热交替法细菌、病毒细菌、病毒4.4.低渗裂解低渗裂解红细胞红细胞 化学法化学法1.1.有机溶剂有机溶剂细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液2.2.去垢剂去垢剂组织、培养细胞、组织、培养细胞、血液血液3.3.酶解法酶解法细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液2、核酸的分离与纯化：、核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离
11、他物质分离他物质分离他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用少
12、数盐类可使用70-75%70-75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤 4.核酸的鉴定核酸的鉴定 浓度鉴定浓度鉴定 纯度鉴定纯度鉴定 完整性鉴定完整性鉴定浓度鉴定浓度鉴定DNADNA：1 1 1 1）紫外分光光度法：测定）紫外分光光度法：测定）紫外分光光度法：测定）紫外分光光度法：测定DNADNADNADNA在在在在A A A A260nm260nm260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。的光吸收值。的光吸收值。如计算如计算如计算如计算DNADNADNADNA浓度浓度浓度浓度A A A A260260260260稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数50505050 g/mlg/mlg/mlg/ml紫紫紫紫外
13、外外外分分分分光光光光光光光光度度度度法法法法只只只只用用用用于于于于测测测测定定定定浓浓浓浓度度度度大大大大于于于于0.25ug/ml0.25ug/ml的的的的核核核核酸酸酸酸溶液。溶液。溶液。溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）RNARNA：l紫外吸光光度法紫外吸光光度法:A A260260稀释倍数稀释倍数4040 g/mlg/ml(OD260-OD320)(OD260-OD320)稀释倍数稀释倍数4040 g/mlg/ml2 2）荧光光度法）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发荧光染料溴化乙锭，可嵌
14、入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析（适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）EB与DNA的结合纯度鉴定纯度鉴定紫外分光光度法：紫外分光光度法：l在在260nm260nm和和280nm280nm处测定处测定DANDAN溶液的光吸收，纯的溶液的光吸收，纯的DNA ADNA A260260与与A A280280之比应之比应在在1.80 1.80(1.601.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有于此值表明有RNARNA的残留量的残留量l纯的纯的RNA
15、ARNA A260260与与A A280280之比应在之比应在2.0(1.2.0(1.802.00),Ratio0),Ratio1.8:2.2:RNA;Ratio2.2:RNA可能已经水解成单核苷酸可能已经水解成单核苷酸A260/A280比值是纯度检测的重要指标！比值是纯度检测的重要指标！注：注：测定吸光定吸光值，稀，稀释液液应使用使用完整性鉴定完整性鉴定凝胶电泳法：凝胶电泳法：l基因组基因组DNADNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；可出现电泳图谱脱尾现象；l总总RNARNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在电泳，观测各条带的
16、含量，提示是否存在RNARNA降解；如加样槽中存在条带，可能是降解；如加样槽中存在条带，可能是DNADNA污染。污染。DNA完整性鉴定：完整性鉴定：正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示RNA的降解的降解RNA完整性鉴定：完整性鉴定：5、核酸的贮存、核酸的贮存DNA保存保存1 1 1 1）短期贮存：）短期贮存：）短期贮存：）短期贮存：4444或或或或-20-20-20-20存放于存放于存放于存放于TETETETE（tristristristris和和和和EDTAEDTAEDTAEDTA）缓冲液中。缓冲液中。缓冲液中。缓冲液中。TE
17、TETETE缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液的的的的PHPHPHPH与与与与DNA DNA DNA DNA 贮贮贮贮存存存存有有有有关关关关，PHPHPHPH为为为为8 8 8 8时时时时，可可可可减减减减少少少少DNADNADNADNA脱氨反应，脱氨反应，脱氨反应，脱氨反应，PHPHPHPH低于低于低于低于7.07.07.07.0时时时时DNADNADNADNA容易变性。容易变性。容易变性。容易变性。2 2 2 2）长期贮存：）长期贮存：）长期贮存：）长期贮存：TETETETE缓冲液中缓冲液中缓冲液中缓冲液中-70-70-70-70保存数年；在保存数年；在保存数年；在保存数年；在DNADNADNAD
18、NA溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。核酸的贮存核酸的贮存RNA保存：保存：lRNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70保存。lRNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20 保存。lRNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制RNA酶对RNA的降解三、基因组三、基因组DNA的分的分离与纯化离与纯化（一）、（一）、DNA样品准备样品准备l 常见的标本：常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等血液、尿液、唾液、组织及培
19、养细胞等l 生物组织：生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 7070或液氮或液氮DNA提取前样本采集、提取前样本采集、预处理和保存：预处理和保存：l全血全血 抗凝剂：EDTA-Na2 或枸橼酸钠或枸橼酸钠 作为抗凝剂作为抗凝剂 不宜使用肝素不宜使用肝素 抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80保存2个月，第10天收率90%4 第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差（二）、（二）、DNA提取提取（一）酚抽提法：（一）酚抽提法：先先用用EDTAEDTA、SDS SDS、蛋蛋白白酶酶K K破破碎碎
20、细细胞胞，消消化化蛋蛋白白，然然后后用用pH8pH8的的TrisTris饱饱和和酚酚或或酚酚-氯氯仿仿抽抽提提DNADNA，最最后后乙乙醇醇或或异异丙丙醇醇进进行行沉淀。获沉淀。获DNADNA大小为大小为100100150kb150kb。酚酚抽抽提提法法提提取取步步骤：骤：DNA酚抽提法示意图主要试剂的作用：主要试剂的作用：EDTAEDTA：1.1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2.2.降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性SDS的作用：的作用：1.1.1.1.溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋
21、白和脂肪，从而使细胞膜破裂2.2.2.2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来释放出来释放出来释放出来3.3.3.3.对对对对RNARNARNARNA、DNADNADNADNA酶有抑制作用酶有抑制作用酶有抑制作用酶有抑制作用4.4.4.4.与蛋白质形成与蛋白质形成与蛋白质形成与蛋白质形成R-O-SO3.RR-O-SO3.RR-O-SO3.RR-O-SO3.R蛋白质复合物，蛋白质复合物，蛋白质复合物，蛋白质复合物，使蛋白质变性使蛋白质变性使蛋白质变性使蛋白质变性蛋白酶蛋白酶K：l水解蛋白
22、质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化DNADNA酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质l蛋白酶蛋白酶K K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在力，而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可 同时使用同时使用苯酚：苯酚：l蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制DNADNA酶活性酶活性l苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水l提取提取DNADNA前苯酚用前苯酚用Tris-HclTris-Hcl饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多DNADNA，降低降低DNADNA的损失率的损失率l氧化苯酚会破坏氧
23、化苯酚会破坏DNADNADNA的沉淀：的沉淀：1）无水乙醇沉淀）无水乙醇沉淀l沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。荷，有助于分子之间的聚集。l无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。的损伤。2）异丙醇沉淀）异丙醇沉淀l 除了使除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子分子（二）（二）甲酰胺解
24、聚法：甲酰胺解聚法：l破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与质与DNADNA的结合，再透析获得的结合，再透析获得DNADNA。高浓度甲酰高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与胺可以裂解蛋白质与DNADNA的复合物，可以使蛋的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤白质变性。减少了酚多次抽提的步骤l甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。（三）磁珠法：（三）磁珠法：l磁珠在高盐低磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐值下吸附核酸，在低盐
25、高高pH值下与核酸分离，再通过移动磁珠值下与核酸分离，再通过移动磁珠来获取来获取DNA（四）微柱法（四）微柱法 ：l利用利用DNA在高盐、低在高盐、低pH的特定溶液环境下可吸的特定溶液环境下可吸附在固相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，附在固相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或溶解到纯水或TE中中（三）、（三）、DNA的浓缩的浓缩l固固体体聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）浓浓缩缩：用用透透析析袋袋 外敷外敷PEGPEG至合适量至合适量l丁丁醇醇抽抽提提浓浓缩缩：DNADNA溶溶液液中中水水可可分分配配到到正正丁丁醇醇或或仲仲丁丁醇醇，但但D
26、NADNA不不会会。因因此此重重复复几几次可显著减少次可显著减少DNADNA体积体积（四）、（四）、DNA回收回收l主要是从电泳中分离回收主要是从电泳中分离回收DNADNA片段片段l回收原则：尽量提高回收率回收原则：尽量提高回收率 去除回收去除回收DNADNA样品中的污染物样品中的污染物lDNA降解的原因降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量样本本身存在大量DNA酶酶l提取提取DNA的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？提取的基因组提取的基因组DNA盐浓度过高盐浓度过高 基因组基因组DNA中乙醇未清除净中乙醇未清除净 基因组基因组DNA中可能存
27、在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素l提取基因组提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护加入多糖，保护DNA长度长度影响影响DNA质量的因素质量的因素四、四、RNA的分离与纯化的分离与纯化（一）、样本来源（一）、样本来源l理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取可以提取RNAl样本选择取决于试验目的样本选择取决于试验目的l全血是基因组提取全血是基因组提取RNA最常见的样本最常见的样本每个细胞的每个细胞的RNA量约为量约为10-5 g 80%-85%rRNA 10%-15%tRNA 1%-5%mRNA 其他其他RNA：hnRN
28、A、snRNA、snoRNA组织材料组织材料起始样品量起始样品量Total RNA提取量提取量blood1ml1520gleukocytes110107 7个个约约100 gLiver tissue1g约约5000 gCulture cells110107 7个个约约100gRenal tissue1g约约3000gSkeleton tissue1g约约1500gCerebral tissue1g约约1500g（二）、（二）、RNA提取的独特性提取的独特性关于关于RNase酶酶l临临床床标标本本及及实实验验室室环环境境中中,存存在在大大量量对对RNARNA具具有有强强烈烈降降解解作作用用的的R
29、NaseRNase，而而RNaseRNase较较耐耐高温高温,不易失活不易失活l如如何何避避免免RNaseRNase对对标标本本的的污污染染及及防防止止RNaseRNase对对提提取取的的RNARNA的的降降解解,是是保保证证RNARNA成成功功提提取取的的关键之所在关键之所在RNase酶酶lRNARNA易易被被RNaseRNase水水解解，RNaseRNase除除胞胞内内还还广广泛泛存存在在于于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中lRNaseRNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键lRNaseRNase分分子子结结构构中中的的二二硫硫
30、键键使使其其生生物物学学活活性性非非常常稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，RNaseRNase的活性又可恢复的活性又可恢复l去去除除RNaseRNase的的污污染染及及强强有有力力地地抑抑制制其其活活性性是是RNARNA制备成功与否的关键制备成功与否的关键l必必须须在在总总RNARNA提提取取分分离离的的最最初初阶阶段段，尽尽可可能能地地灭活胞内灭活胞内RNaseRNase的活性的活性1.内源性内源性RNA酶（酶（intrinsic RNase）2.外源性外源性RNA酶酶(extrinsic RNase)主要来源：主要来源：l l 被污染的缓冲液细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶l自
31、动移液装置3.实验室采取避免实验室采取避免RNA酶污染的措施酶污染的措施l设置专门设置专门RNA移液装置移液装置l小份保存缓冲液小份保存缓冲液l设置专门的设置专门的RNA电泳装置电泳装置l准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶的器皿、酶的器皿、DEPC处理水等处理水等l分离分离RNA过程中使用过程中使用RNA酶抑制剂酶抑制剂4.RNA酶的去除酶的去除l lDEPC（焦碳酸二乙酯）l l高度活化的烷基化试剂，破坏高度活化的烷基化试剂，破坏RNARNA酶活性。用酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的来灭活缓冲液或器皿中的RNARNA酶。酶。OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O
32、=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用的过程中不使用DEPC5.RNA提取所用器皿的处理提取所用器皿的处理l经经高高压压灭灭菌菌的的一一次次性性使使用用的的塑塑料料制制品品如如试试管管,离离心心管管等等基基本上无本上无RNaseRNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA RNA l实实验验
33、室室用用的的普普通通玻玻璃璃器器皿皿经经常常有有RNaseRNase污污染染,使使用用前前必必须须于于180180干干烤烤8 8小小时时以以上上,或或用用0.1%0.1%焦焦碳碳酸酸二二乙乙酯酯(DEPC)(DEPC)的的水水溶液浸泡用于制备溶液浸泡用于制备RNARNA的烧杯的烧杯,试管和其它用品试管和其它用品lDEPCDEPC是是RNaseRNase的的强强烈烈抑抑制制剂剂。灌灌满满DEPCDEPC的的器器皿皿于于3737下下放放置置2 2小小时时，然然后后用用灭灭菌菌水水淋淋洗洗数数次次，并并于于100100干干烤烤1515分分钟钟，最最后后高高压压蒸蒸汽汽下下1515分分钟钟。上上述述处
34、处理理可可除除去去器器皿皿上上痕痕量量的的DEPC,DEPC,以以防防DEPCDEPC通通过过羧羧甲甲基基化化作作用用对对RNARNA的的嘌嘌呤呤碱碱基基进进行行修修饰饰6.RNA提取所用溶液的准备提取所用溶液的准备l对对于于RNARNA提提取取所所需需溶溶液液的的配配制制,必必须须用用高高压压灭灭菌菌的的水水和和RNARNA研研究究专专用用的的化化学学试试剂剂配配制制溶溶液液,用用干干烤烤过过的的药药匙匙称称取取试试剂剂,将将溶溶液液装装入入无无RNaseRNase的的玻玻璃璃器器皿皿。可可能能的的话话,溶溶液液均均应应用用0.1%DEPC0.1%DEPC于于3737至至少少处处理理1212
35、小小时时,然然后后于于100100加加热热1515分分钟钟或或高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌1515分钟分钟l须须注注意意的的是是,DEPC,DEPC可可与与胺胺类类迅迅速速发发生生化化学学反反应应,因因此此不不能能用用来来处处理理含含有有TrisTris一一类类的的缓缓冲冲液液,因因此此可可存存几几瓶瓶新新的的,未未开开封封的的TrisTris试试剂剂以以制制备备无无RNaseRNase的的溶溶液液7.RNA提取中提取中RNase 污染的控制污染的控制l实验操作人员的手是RNase污染最主要的潜在来源。l策略是：l在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时,以及在涉及RNA的整个提取操作过程中,都应戴
36、一次性手套l在RNA提取实验中，应勤换手套（三）、用于提取（三）、用于提取RNA的血样的处理的血样的处理1.取新鲜抗凝血取新鲜抗凝血23ml入入15ml无菌塑料管，无菌塑料管，600g离心离心5分钟，分钟，弃上清。弃上清。2.加入加入6倍细胞体积的红细胞裂解液（约倍细胞体积的红细胞裂解液（约12ml），轻轻吹打混），轻轻吹打混匀，本步骤在室温或匀，本步骤在室温或4度操作均可。裂解时间至度操作均可。裂解时间至4-5分钟，并分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。3.600g离心离心5分钟，弃红色上清。分钟，弃红色上清。4离心效果更佳。离心效
37、果更佳。4.一般情况下，一般情况下，裂解裂解1次红细胞应该裂解的差不多，如果有较次红细胞应该裂解的差不多，如果有较多红细胞没有裂解的话，可以再加点红细胞裂解液约多红细胞没有裂解的话，可以再加点红细胞裂解液约5ml裂裂解解1次。步骤同次。步骤同3。5.向得到的细胞团中加向得到的细胞团中加Trizol 1.0ml，弹匀，将细胞团打散，弹匀，将细胞团打散，转入转入1.5ml无菌塑料管，封好盖。标上号，缠上封口膜，无菌塑料管，封好盖。标上号，缠上封口膜，20 或或70 保存。保存。（四）、（四）、RNA提取的常用方法提取的常用方法l表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法l胍盐提取结合氯仿-酚抽提法l胍盐
38、提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等RNA提取实验前的准备提取实验前的准备【使用器具使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用0.1%DEPC0.1%DEPC水溶液在水溶液在3737处理处理12h12h，后，后120120高压高压30min30min，去除残留，去除残留DEPCDEPC【试剂配制试剂配制】无菌水须用无菌水须用0.1%DEPC0.1%DEPC处理后高温高压灭菌处理后高温高压灭菌 RNARNA实验试剂应实验试剂应RNARNA提取专用，避免其他试剂交叉污染提取专用，避免其他试剂交叉污染【其他其他】实验过程中使用一次性手
39、套，并经常更换；在实验过程中使用一次性手套，并经常更换；在RNARNA专用专用区操作，操作过程中避免交谈区操作，操作过程中避免交谈 表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法：1.1.每每mgmg组织中加入组织中加入1mlTrizol1mlTrizol试剂，高速破碎组织（使用试剂，高速破碎组织（使用高速组织捣碎器）高速组织捣碎器）2.2.加入氯仿加入氯仿0.2ml,0.2ml,轻轻颠倒混匀，室温静置分层。轻轻颠倒混匀，室温静置分层。3.3.高速离心高速离心12000rpm12000rpm，4-8 4-8 C C ，1010分钟分钟4.4.吸上清液至新离心管中，约吸上清液至新离心管中，约600ul60
40、0ul5.5.加入加入500ul500ul异丙醇，混匀，室温静置异丙醇，混匀，室温静置1010分钟分钟6.6.高速离心高速离心12000rpm12000rpm，4-8 4-8 C C ，1010分钟分钟7.7.弃上清液，沉淀为弃上清液，沉淀为RNARNA8.8.加入加入1mlDEPC1mlDEPC处理的处理的75%75%乙醇，混匀，乙醇，混匀，7500rpm7500rpm离心，离心，4-4-8 8C C，5 5分钟分钟9.9.加入加入DEPCDEPC处理水处理水30ul30ul，混匀，混匀，55-60 55-60 C C水浴水浴10.10.3ul3ul加入加入297ulDEPC297ulDEP
41、C水，测定浓度和纯度水，测定浓度和纯度异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法试剂的作用：试剂的作用：l加加入入-疏疏基基乙乙醇醇、二二硫硫苏苏糖糖醇醇（DTTDTT）等等还还原原剂剂可可以以还还原原RNaseRNase中中的的二二硫硫键键，有有利利于于RNaseRNase的变性、水解与灭活的变性、水解与灭活（四）、（四）、mRNA的分离纯化的分离纯化l除除血血红红蛋蛋白白及及组组蛋蛋白白的的mRNAmRNA外外，绝绝大大多多数数mRNAmRNA在在其其3 3末端带有长短不同的末端带有长短不同的polypoly（A A）尾巴）尾巴l利利用用碱碱基基配配对对原原则则，通通过过oligooligo（dTdT）-纤纤维维素素或或polypoly（U U）-琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的亲亲和和层层析析，可可以以很很容容易易地地从总从总RNARNA制品中分离纯化制品中分离纯化mRNAmRNA