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1、临床样本的采集运输和保存及核酸提取第一页，讲稿共六十七页哦研究背景研究背景l 样本的采集、处理样本的采集、处理l 样本的保存样本的保存l 样本的运输样本的运输l DNADNA的提取的提取l RNARNA的提取的提取第二页，讲稿共六十七页哦研究背景研究背景一、样本的采集、处一、样本的采集、处 理、保存及运输理、保存及运输第三页，讲稿共六十七页哦临床标本的正确采集、运送、保存临床标本的正确采集、运送、保存的重要性的重要性l l临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节l l解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一解决涉及实验室检验
2、的医患纠纷的方法之一解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一第四页，讲稿共六十七页哦（一）、样本的采集（一）、样本的采集地贫检测样品采集：地贫检测样品采集：l 外周血外周血:5mLl 脐带血脐带血:0.51mLl 羊羊 水：水：2030mLl 绒绒 毛：毛：15mgl 唾唾 液液l 组组 织织第五页，讲稿共六十七页哦标本采集的注意事项标本采集的注意事项l l所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下所有标本的采集、运送和处理应在无菌操
3、作，防止污染的原则下进行进行进行进行l l已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送l l采集足够量标本采集足够量标本采集足够量标本采集足够量标本l l每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时间及相关临床信息间及相关临床信息间及相关临床信息间及相关临
4、床信息第六页，讲稿共六十七页哦全全 血血l l以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用的选择，一般使用EDTA-NaEDTA-Na2 2或枸椽酸钠，不或枸椽酸钠，不可使用肝素可使用肝素l l全血样本如用于全血样本如用于DNADNA提取检测，可提取检测，可44下短下短期保存期保存,如用于如用于RNARNA检测，则应在取血后，检测，则应在取血后，尽快提取尽快提取RNARNA第七页，讲稿共六十七页哦血清（浆）血清（浆）l lDNADNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大对测定影响不大l lRNARNA
5、测定，标本的获取和保存方式对测定结测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用果，可能有决定性影响。最好是使用EDTAEDTA抗凝抗凝(严禁使用肝素严禁使用肝素)全血标本，抗凝后全血标本，抗凝后6 6小小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快快(2(2小时内小时内)分离血清，标本的短期（分离血清，标本的短期（1 12 2周）保存可在周）保存可在-20-20下，较长期保存应在下，较长期保存应在-7070下下 第八页，讲稿共六十七页哦肝素的作用机理肝素的作用机理l l肝素对肝素对肝素对肝素对MLVMLV逆转录酶和逆转录酶和逆转录酶和逆转录酶
6、和TAQ DNATAQ DNA聚合酶均很强的抑制作用，聚合酶均很强的抑制作用，聚合酶均很强的抑制作用，聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的标本中的标本中的标本中的肝素可结合于肝素可结合于肝素可结合于肝素可结合于DNADNA和和和和RNARNA上上上上l l对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸
7、碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用l l每每每每gg核酸标本中加入核酸标本中加入核酸标本中加入核酸标本中加入0.1U0.1U的肝素，即可的肝素，即可的肝素，即可的肝素，即可100%100%的抑制酶活的抑制酶活的抑制酶活的抑制酶活性性性性l l在标本中加入肝素酶在标本中加入肝素酶在标本中加入肝素酶在标本中加入肝素酶I I 或或或或13 U/g13 U/g核酸在于核酸在于核酸在于核酸在于5 mM Tris 5 mM Tris pH7.5,1 mM CaC
8、l2,40 U RNasin 25 pH7.5,1 mM CaCl2,40 U RNasin 25 下作用下作用下作用下作用2 2小时可去除肝小时可去除肝小时可去除肝小时可去除肝素的抑制作用素的抑制作用素的抑制作用素的抑制作用第九页，讲稿共六十七页哦（二）、样本的运送（二）、样本的运送l l样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室l l样本中如加入了适当的稳定剂，如用于样本中如加入了适当的稳定剂，如用于样本中如加入了适当的稳定剂，如用于样本中如加入了适当的稳定剂，如用
9、于DNADNADNADNA测定的测定的测定的测定的EDTAEDTAEDTAEDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄l l建议：将全血标本或建议：将全血标本或建议：将全血标本或建议：将全血标本或DNADNADNADNA样本用冰袋加泡沫盒快递运送。样本用冰袋加泡沫盒快递运送。样本用冰袋加泡沫盒快递运送。样本用冰袋加泡沫盒快递运送。如需提取如需提取如需提取如需提取RNARNARNARNA的样本需预处理后加的样本需预处理后加的样本需预处理后加的样本需预处理后加lml Trizollml Trizollml
10、Trizollml Trizol在低温运在低温运在低温运在低温运送送送送第十页，讲稿共六十七页哦（三）、样本的保存（三）、样本的保存l l常规外周血标本，采集后做血常规，常温常规外周血标本，采集后做血常规，常温常规外周血标本，采集后做血常规，常温常规外周血标本，采集后做血常规，常温2424小时内，小时内，小时内，小时内，4 4可保可保可保可保存存存存1 1周；做血红蛋白电泳常温周；做血红蛋白电泳常温周；做血红蛋白电泳常温周；做血红蛋白电泳常温1 1周，电泳周，电泳周，电泳周，电泳4 4可保存可保存可保存可保存1515天；天；天；天；DNADNA提提提提取样本常温取样本常温取样本常温取样本常温2
11、424小时，小时，小时，小时，4 4保存保存保存保存1 1个星期，个星期，个星期，个星期，20 20 保存保存保存保存3 3个月，个月，个月，个月，70 70 保存半年保存半年保存半年保存半年3 3年；年；年；年；RNARNA提取样本常温提取样本常温提取样本常温提取样本常温6 6小时，小时，小时，小时，4 4保存保存保存保存1212小时，小时，小时，小时，70 70 保存保存保存保存3 3个月，羊水在个月，羊水在个月，羊水在个月，羊水在1212小时内离心可保存同上。小时内离心可保存同上。小时内离心可保存同上。小时内离心可保存同上。第十一页，讲稿共六十七页哦研究背景研究背景 二、核酸的提取二、核
12、酸的提取第十二页，讲稿共六十七页哦核酸提取的重要性核酸提取的重要性l l核酸提取是临床核酸提取是临床PCRPCR检验最为关键的部分，检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分亦是手式操作的主要部分l l核酸提取的成败关系到临床核酸提取的成败关系到临床PCRPCR检验的正确检验的正确与否与否l l临床临床PCRPCR检验操作中最易出问题的环节检验操作中最易出问题的环节第十三页，讲稿共六十七页哦（一）、提取核酸总的原则（一）、提取核酸总的原则l l保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；l l其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物
13、大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低分子的污染应降低到最低分子的污染应降低到最低分子的污染应降低到最低程度；程度；程度；程度；l l核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；浓度的金属离子；浓度的金属离子；浓度的金属离子；l l其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取DNADNADNADNA中的中的中的中的RN
14、ARNARNARNA，也应尽量去除。，也应尽量去除。，也应尽量去除。，也应尽量去除。第十四页，讲稿共六十七页哦（二）、核酸提取的基本步骤（二）、核酸提取的基本步骤1 1、核酸的释放：核酸的释放：核酸的释放：核酸的释放：破裂细胞破裂细胞破裂细胞破裂细胞 释放核酸释放核酸释放核酸释放核酸 机械法与非机械法机械法与非机械法机械法与非机械法机械法与非机械法 （非机械法中（非机械法中（非机械法中（非机械法中溶胞法溶胞法溶胞法溶胞法是应最广泛的方法）是应最广泛的方法）是应最广泛的方法）是应最广泛的方法）第十五页，讲稿共六十七页哦各种组织细胞破碎方法各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法 应用应用 机
15、械法机械法1.1.匀浆法匀浆法机体软组织机体软组织2.2.捣碎法捣碎法动物韧性组织动物韧性组织3.3.研磨法研磨法细菌、酵母细菌、酵母 物理法物理法1.1.超声法超声法细胞混悬液细胞混悬液2.2.反复冻融法反复冻融法培养细胞培养细胞3.3.冷热交替法冷热交替法细菌、病毒细菌、病毒4.4.低渗裂解低渗裂解红细胞红细胞 化学法化学法1.1.有机溶剂有机溶剂细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液2.2.去垢剂去垢剂组织、培养细胞、组织、培养细胞、血液血液3.3.酶解法酶解法细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液第十六页，讲稿共六十七页哦2 2、核酸的分离与纯化：、核酸的分离与纯化：、核酸的分离与纯化：、核酸的分
16、离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离他物质分离他物质分离他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液第十七页，讲稿共六十七页哦3 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的
17、浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用少数盐类可使用70-75%70-75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤第十八页，讲稿共六十七页哦 4.4.核酸的鉴定核酸的鉴定核酸的鉴定核酸的鉴定 浓度鉴定浓度鉴定 纯度鉴定纯度鉴定 完整性鉴定完整性鉴定第十九页，讲稿共六十七页哦浓度鉴定浓度鉴定DNADNA：1 1 1 1）紫外分光光度法：测定）紫外分光光度法：测定）紫外分光光度法：测定）紫外分光光度法：测定
18、DNADNADNADNA在在在在A A A A260nm260nm260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。的光吸收值。的光吸收值。如计算如计算如计算如计算DNADNADNADNA浓度浓度浓度浓度A A A A260260260260稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数50505050 g/mlg/mlg/mlg/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于紫外分光光度法只用于测定浓度大于紫外分光光度法只用于测定浓度大于紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml0.25ug/ml的核酸溶液。的核酸溶液。的核酸溶液。的核酸溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或
19、RNA，20g/ml单链寡核苷酸）第二十页，讲稿共六十七页哦RNARNA：l l紫外吸光光度法紫外吸光光度法:A A260260稀释倍数稀释倍数4040 g/mlg/ml(OD260-OD320)(OD260-OD320)稀释倍数稀释倍数4040 g/mlg/ml第二十一页，讲稿共六十七页哦2 2 2 2）荧光光度法）荧光光度法）荧光光度法）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。且荧光强度与核酸含量呈正
20、比。且荧光强度与核酸含量呈正比。且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析（适用于低浓度核酸溶液的定量分析（适用于低浓度核酸溶液的定量分析（适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng1-5ng）第二十二页，讲稿共六十七页哦EB与DNA的结合第二十三页，讲稿共六十七页哦纯度鉴定纯度鉴定紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法：l l在在在在260nm260nm260nm260nm和和和和280nm280nm280nm280nm处测定处测定处测定处测定DANDANDANDAN溶液的光吸收，纯的溶液的光吸收，纯的溶液的光吸收，纯的溶液的光吸收，纯的DNA ADN
21、A ADNA ADNA A260260260260与与与与A A A A280280280280之比应在之比应在之比应在之比应在1.80 1.80 1.80 1.80(1.601.80)(1.601.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNARNARNARNA的残留量的残留量的残留量的残留量l l纯的纯的纯的纯的RNA ARNA ARNA ARNA A260260260260与与与与A A A A28028028028
22、0之比应在之比应在之比应在之比应在2.0(1.2.0(1.2.0(1.2.0(1.802.0802.00),Ratio1.8:0),Ratio1.8:0),Ratio1.8:0),Ratio2.2:RNARatio2.2:RNARatio2.2:RNARatio2.2:RNA可能已经水解成单核苷酸可能已经水解成单核苷酸可能已经水解成单核苷酸可能已经水解成单核苷酸A260/A280比值是纯度检测的重要指标！比值是纯度检测的重要指标！注：注：注：注：测测定吸光定吸光定吸光定吸光值值，稀，稀，稀，稀释释液液液液应应使用使用使用使用第二十四页，讲稿共六十七页哦完整性鉴定完整性鉴定凝胶电泳法：凝胶电泳法
23、：l l基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；电泳图谱脱尾现象；电泳图谱脱尾现象；电泳图谱脱尾现象；l l总总总总RNARNARNARNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在电泳，观测各条带的含量，提示是否存在电泳，观测各条带的含量，提示是否存在电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNARNARNARNA降解；降解；降解；降解；如加样槽中存在条带，可能是如加样槽中存在条带，可能是如加样槽中存在条带，可
24、能是如加样槽中存在条带，可能是DNADNADNADNA污染。污染。污染。污染。第二十五页，讲稿共六十七页哦DNA完整性鉴定：完整性鉴定：第二十六页，讲稿共六十七页哦正常时，正常时，28S RNA的荧光强度约为的荧光强度约为18S RNA的的2倍，倍，否则提示否则提示RNA的降的降解解RNA完整性鉴定：完整性鉴定：第二十七页，讲稿共六十七页哦5 5、核酸的贮存、核酸的贮存、核酸的贮存、核酸的贮存DNADNA保存保存保存保存1 1 1 1）短期贮存：）短期贮存：）短期贮存：）短期贮存：4444或或或或-20-20-20-20存放于存放于存放于存放于TETETETE（tristristristris
25、和和和和EDTAEDTAEDTAEDTA）缓冲液中。）缓冲液中。）缓冲液中。）缓冲液中。TETETETE缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液的的的的PHPHPHPH与与与与DNA DNA DNA DNA 贮贮贮贮存存存存有有有有关关关关，PHPHPHPH为为为为8 8 8 8时时时时，可可可可减减减减少少少少DNADNADNADNA脱脱脱脱氨氨氨氨反反反反应，应，应，应，PHPHPHPH低于低于低于低于7.07.07.07.0时时时时DNADNADNADNA容易变性。容易变性。容易变性。容易变性。2 2 2 2）长期贮存：）长期贮存：）长期贮存：）长期贮存：TETETETE缓冲液中缓冲液中缓冲液中缓冲液中
26、-70-70-70-70保存数年；在保存数年；在保存数年；在保存数年；在DNADNADNADNA溶液中加一滴氯仿可有溶液中加一滴氯仿可有溶液中加一滴氯仿可有溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。效防止细菌和核酸的污染。效防止细菌和核酸的污染。效防止细菌和核酸的污染。第二十八页，讲稿共六十七页哦核酸的贮存核酸的贮存核酸的贮存核酸的贮存RNARNA保存：保存：保存：保存：l lRNARNA可溶于可溶于0.3mol/L0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在的醋酸钠溶液或双蒸水，在-7070保存。保存。l lRNARNA可溶于可溶于70%70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可的乙醇溶液或去
27、离子的甲酰胺溶液中，可在在-20-20 保存。保存。l lRNARNA如果以如果以DEPCDEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制（焦碳酸二乙酯）可以抑制RNARNA酶对酶对RNARNA的降解的降解第二十九页，讲稿共六十七页哦三、基因组三、基因组DNA的分离的分离与纯化与纯化第三十页，讲稿共六十七页哦（一）、（一）、DNA样品准备样品准备l l 常见的标本：常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等l l 生物组织：生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 7070或液氮或液氮第三十一页，讲稿共六十七页哦DNA提取前样本采
28、集、提取前样本采集、预处理和保存：预处理和保存：l l全血全血 抗凝剂：EDTA-Na2EDTA-Na2 或枸橼酸钠或枸橼酸钠或枸橼酸钠或枸橼酸钠 作为抗凝剂作为抗凝剂作为抗凝剂作为抗凝剂 不宜使用肝素不宜使用肝素不宜使用肝素不宜使用肝素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80保存2个月，第10天收率90%4 第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差第三十二页，讲稿共六十七页哦（二）、（二）、DNA提取提取（一）酚抽提法：（一）酚抽提法：先先用用EDTAEDTA、SDS SDS、蛋蛋白白酶酶K K破破碎碎细细胞胞，消消化化蛋蛋白白，然然后
29、后用用pH8pH8的的TrisTris饱饱和和酚酚或或酚酚-氯氯仿仿抽抽提提DNADNA，最最后后乙乙醇醇或或异异丙丙醇醇进进行行沉淀。获沉淀。获DNADNA大小为大小为100100150kb150kb。第三十三页，讲稿共六十七页哦酚酚抽抽提提法法提提取取步步骤：骤：第三十四页，讲稿共六十七页哦DNA酚抽提法示意图第三十五页，讲稿共六十七页哦主要试剂的作用：主要试剂的作用：主要试剂的作用：主要试剂的作用：EDTAEDTA：1.1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2.2.降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性第三十六页，讲稿共六十七页哦SDSSDS的作用：的作用：的作用：的
30、作用：1.1.1.1.溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂2.2.2.2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来释放出来释放出来释放出来3.3.3.3.对对对对RNARNARNARNA、DNADNADNADNA酶有抑制作用酶有抑制作用酶有抑制作用酶有抑制作用4.4.4.4.与蛋白质形成与蛋白质形成与蛋白质形成与蛋白质形成R-O-SO3 R-O-SO3 R-O-SO3 R-O-SO3.R.R
31、.R.R蛋白质复合物，使蛋蛋白质复合物，使蛋蛋白质复合物，使蛋蛋白质复合物，使蛋白质变性白质变性白质变性白质变性第三十七页，讲稿共六十七页哦蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K：l l水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化DNADNADNADNA酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质l l蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在力，而且在力，而且在力，而且在SDSS
32、DSSDSSDS、EDTAEDTAEDTAEDTA存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可 同时使用同时使用同时使用同时使用第三十八页，讲稿共六十七页哦苯酚：苯酚：苯酚：苯酚：l l蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制DNADNADNADNA酶活性酶活性酶活性酶活性l l苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水l l提取提取提取提取DNADNADNADNA前苯酚用前苯酚用前苯酚用前苯酚用Tris-HclTris-HclTris-Hc
33、lTris-Hcl饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多DNADNADNADNA，降，降，降，降低低低低DNADNADNADNA的损失率的损失率的损失率的损失率l l氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏DNADNADNADNA第三十九页，讲稿共六十七页哦DNADNA的沉淀：的沉淀：的沉淀：的沉淀：1 1）无水乙醇沉淀）无水乙醇沉淀）无水乙醇沉淀）无水乙醇沉淀l l沉淀前往往加入沉淀前往往加入沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaClNaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分等盐离子
34、，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。子之间的聚集。子之间的聚集。子之间的聚集。l l无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNADNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少可以减少可以减少可以减少DNADNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNADNA的损伤。的损伤。的损伤。的损伤。2 2）异
35、丙醇沉淀）异丙醇沉淀）异丙醇沉淀）异丙醇沉淀l l 除了使除了使除了使除了使DNADNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNARNA分子分子分子分子第四十页，讲稿共六十七页哦（二）（二）甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法：l l破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与与与与DNADNADNADNA的结合，再透析获得的结合，再透析获得的结合，再透析获得的结合，再透析获得DNADNADNADNA。高
36、浓度甲酰胺可。高浓度甲酰胺可。高浓度甲酰胺可。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与以裂解蛋白质与以裂解蛋白质与以裂解蛋白质与DNADNADNADNA的复合物，可以使蛋白质变性。的复合物，可以使蛋白质变性。的复合物，可以使蛋白质变性。的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤减少了酚多次抽提的步骤减少了酚多次抽提的步骤减少了酚多次抽提的步骤l l甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNADNADNADNA样品。可得样品。可得样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 20
37、0kbDNA 200kbDNA 200kb左右。左右。左右。左右。第四十一页，讲稿共六十七页哦（三）磁珠法：（三）磁珠法：l l磁珠在高盐低磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐值下吸附核酸，在低盐高高pH值下与核酸分离，再通过移动磁珠值下与核酸分离，再通过移动磁珠来获取来获取DNA第四十二页，讲稿共六十七页哦（四）微柱法（四）微柱法 ：l l利用利用利用利用DNADNA在高盐、低在高盐、低在高盐、低在高盐、低pHpH的特定溶液环境下可吸附在固的特定溶液环境下可吸附在固的特定溶液环境下可吸附在固的特定溶液环境下可吸附在固相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液相介质（如硅胶膜）上，洗涤去
38、除杂质后，再改变溶液相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使环境使环境使环境使DNADNA溶解到纯水或溶解到纯水或溶解到纯水或溶解到纯水或TETE中中中中第四十三页，讲稿共六十七页哦（三）、（三）、DNA的浓缩的浓缩l l固固体体聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）浓浓缩缩：用用透透析析袋袋 外敷外敷PEGPEG至合适量至合适量l l丁丁醇醇抽抽提提浓浓缩缩：DNADNA溶溶液液中中水水可可分分配配到到正正丁丁醇醇或或仲仲丁丁醇醇，但但DNADNA不不会会。因因此此重重复复几几次可显著减少次可显著减少DNADNA体积体积第四十四页，讲稿
39、共六十七页哦（四）、（四）、DNA回收回收l l主要是从电泳中分离回收主要是从电泳中分离回收DNADNA片段片段l l回收原则：尽量提高回收率回收原则：尽量提高回收率 去除回收去除回收DNADNA样品中的污染物样品中的污染物第四十五页，讲稿共六十七页哦l lDNADNA降解的原因降解的原因降解的原因降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量样本本身存在大量样本本身存在大量样本本身存在大量DNADNA酶酶酶酶l l提取提取提取提取DNADNA的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？的生物活性差的原
40、因？的生物活性差的原因？提取的基因组提取的基因组提取的基因组提取的基因组DNADNA盐浓度过高盐浓度过高盐浓度过高盐浓度过高 基因组基因组基因组基因组DNADNA中乙醇未清除净中乙醇未清除净中乙醇未清除净中乙醇未清除净 基因组基因组基因组基因组DNADNA中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素l l提取基因组提取基因组提取基因组提取基因组DNADNA，有时加入蔗糖的原因，有时加入蔗糖的原因，有时加入蔗糖的原因，有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护加入多糖，保护加入多糖，保护加入多糖，保护DNADNA长度长度长度长度影响影响DNA质量的因素质量的因
41、素第四十六页，讲稿共六十七页哦四、四、RNA的分离与纯化的分离与纯化第四十七页，讲稿共六十七页哦（一）、样本来源（一）、样本来源l l理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取可以提取RNAl l样本选择取决于试验目的样本选择取决于试验目的l l全血是基因组提取全血是基因组提取RNA最常见的样本最常见的样本第四十八页，讲稿共六十七页哦每个细胞的每个细胞的每个细胞的每个细胞的RNARNA量约为量约为量约为量约为1010-5-5 g g 80%-85%rRNA 80%-85%rRNA 10%-15%tRNA 10%-15%tRNA 1%-5%mRNA 1%-5
42、%mRNA 其他其他其他其他RNARNA：hnRNAhnRNA、snRNA snRNA、snoRNAsnoRNA第四十九页，讲稿共六十七页哦组织材料组织材料起始样品量起始样品量Total RNA提取量提取量blood1ml1520gleukocytes110107 7个个约约100 gLiver tissue1g约约5000 gCulture cells110107 7个个约约100gRenal tissue1g约约3000gSkeleton tissue1g约约1500gCerebral tissue1g约约1500g第五十页，讲稿共六十七页哦（二）、（二）、RNA提取的独特性提取的独特性关
43、于关于RNase酶酶l l临临床床标标本本及及实实验验室室环环境境中中,存存在在大大量量对对RNARNA具具有有强强烈烈降降解解作作用用的的RNaseRNase，而而RNaseRNase较较耐耐高温高温,不易失活不易失活l l如如何何避避免免RNaseRNase对对标标本本的的污污染染及及防防止止RNaseRNase对对提提取取的的RNARNA的的降降解解,是是保保证证RNARNA成成功功提提取取的的关键之所在关键之所在第五十一页，讲稿共六十七页哦RNase酶酶l lRNARNARNARNA易易易易被被被被RNaseRNaseRNaseRNase水水水水解解解解，RNaseRNaseRNase
44、RNase除除除除胞胞胞胞内内内内还还还还广广广广泛泛泛泛存存存存在在在在于于于于人人人人的的的的皮皮皮皮肤、唾液、汗液及周围的环境中肤、唾液、汗液及周围的环境中肤、唾液、汗液及周围的环境中肤、唾液、汗液及周围的环境中l lRNaseRNaseRNaseRNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键l lRNaseRNaseRNaseRNase分分分分子子子子结结结结构构构构中中中中的的的的二二二二硫硫硫硫键键键键使使使使其其其其生生生生物物物物学学学学活活活活性性性性非非非非常常常常稳稳稳稳定定定定，去去去去除变性剂
45、后，除变性剂后，除变性剂后，除变性剂后，RNaseRNaseRNaseRNase的活性又可恢复的活性又可恢复的活性又可恢复的活性又可恢复第五十二页，讲稿共六十七页哦l l去去去去除除除除RNaseRNaseRNaseRNase的的的的污污污污染染染染及及及及强强强强有有有有力力力力地地地地抑抑抑抑制制制制其其其其活活活活性性性性是是是是RNARNARNARNA制制制制备成功与否的关键备成功与否的关键备成功与否的关键备成功与否的关键l l必必必必须须须须在在在在总总总总RNARNARNARNA提提提提取取取取分分分分离离离离的的的的最最最最初初初初阶阶阶阶段段段段，尽尽尽尽可可可可能能能能地地地
46、地灭灭灭灭活活活活胞内胞内胞内胞内RNaseRNaseRNaseRNase的活性的活性的活性的活性1.内源性内源性RNA酶（酶（intrinsic RNase）第五十三页，讲稿共六十七页哦2.外源性外源性RNA酶酶(extrinsic RNase)主要来源：主要来源：l l 被污染的缓冲液被污染的缓冲液细菌或微生物污染，高压不能去除细菌或微生物污染，高压不能去除RNARNA酶酶l l 自动移液装置自动移液装置第五十四页，讲稿共六十七页哦3.实验室采取避免实验室采取避免RNA酶污染的措施酶污染的措施l l设置专门设置专门设置专门设置专门RNARNA移液装置移液装置移液装置移液装置l l小份保存缓
47、冲液小份保存缓冲液小份保存缓冲液小份保存缓冲液l l设置专门的设置专门的设置专门的设置专门的RNARNA电泳装置电泳装置电泳装置电泳装置l l准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无RNARNA酶的器皿、酶的器皿、酶的器皿、酶的器皿、DEPCDEPC处理水等处理水等处理水等处理水等l l分离分离分离分离RNARNA过程中使用过程中使用过程中使用过程中使用RNARNA酶抑制剂酶抑制剂酶抑制剂酶抑制剂第五十五页，讲稿共六十七页哦4.RNA酶的去除酶的去除l lDEPC（焦碳酸二乙酯）l l高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭
48、活缓冲液或器皿中的RNA酶。OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用的过程中不使用DEPC第五十六页，讲稿共六十七页哦5.RNA提取所用器皿的处理提取所用器皿的处理l l经经经经高高高高压压压压灭灭灭灭菌菌菌菌的的的的一一一一次次次次性性性性使使使使用用用用的的的的塑塑塑塑料料料料制制制
49、制品品品品如如如如试试试试管管管管,离离离离心心心心管管管管等等等等基基基基本本本本上上上上无无无无RNase,RNase,RNase,RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存可以不经预处理直接用于制备和贮存可以不经预处理直接用于制备和贮存可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA RNA RNA RNA l l实实实实验验验验室室室室用用用用的的的的普普普普通通通通玻玻玻玻璃璃璃璃器器器器皿皿皿皿经经经经常常常常有有有有RNaseRNaseRNaseRNase污污污污染染染染,使使使使用用用用前前前前必必必必须须须须于于于于180180180180干干干干烤烤烤烤8 8 8 8小小小小时时时
50、时以以以以上上上上,或或或或用用用用0.1%0.1%0.1%0.1%焦焦焦焦碳碳碳碳酸酸酸酸二二二二乙乙乙乙酯酯酯酯(DEPC)(DEPC)(DEPC)(DEPC)的的的的水水水水溶溶溶溶液液液液浸浸浸浸泡泡泡泡用用用用于制备于制备于制备于制备RNARNARNARNA的烧杯的烧杯的烧杯的烧杯,试管和其它用品试管和其它用品试管和其它用品试管和其它用品l lDEPCDEPCDEPCDEPC是是是是RNaseRNaseRNaseRNase的的的的强强强强烈烈烈烈抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂。灌灌灌灌满满满满DEPCDEPCDEPCDEPC的的的的器器器器皿皿皿皿于于于于37373737下下下下放放放放置