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1、ICS 65.020.01 CCS B 10 DB23 黑龙江省地方标准 DB23/T 32372022 黑土耕地土壤微生物肥力评价技术规范 2022-07-07 发布 2022-08-06 实施 黑龙江省市场监督管理局 发 布 DB23/T 32372022 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省农业农村厅提出。本文件起草单位：黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所和哈尔滨芮煊科技有限公司。本文件主要起草人：王爽、孙磊、赵文博、
2、金品娇、高中超、刘凯、李伟群、郝小雨。DB23/T 32372022 1 黑土耕地土壤微生物肥力评价技术规范 1 范围 本文件规定了土壤微生物肥力的术语和定义、土壤样品的采集与预处理、土壤微生物肥力评价项目及测定和黑土耕地微生物肥力评价方法。本文件适用于黑土耕地土壤微生物肥力的评价。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 20287-2006 农用微生物菌剂 GB/T 32723 土壤微生物生物量的测定 底物诱导呼吸法 GB/
3、T 33469-2016 耕地质量等级 NY/T 52-1987 土壤水分测定法 NY/T 1121.1-2006 土壤检测 第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存 LY/T 1220 森林土壤呼吸强度的测定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 土壤微生物肥力 是指土壤中的微生物通过其活动与代谢能够对土壤的物理和化学性质产生积极作用，并为植物根系提供营养的能力。4 土壤样品的采集与预处理 4.1 采样单元确定 根据所评价耕地受自然因素及人为因素对土壤微生态系统影响的需要，按地形特点、成土母质、土地利用方式、覆被变化、气候条件、耕作以及施肥方式等分为若干个采样单元。4.2 采样时间
4、 土壤样品野外采集时间为 7 月-8 月，应根据区域天气和农业管理条件的变化，避开降雨等天气、以及施肥和灌溉等管理时期。4.3 采样方法 DB23/T 32372022 2 同一采样单元内按照“随机”、“等量”和“多点混合”原则。用 GPS 定位仪确定采样地点的地理位置（经纬度），每个样地按照“五点梅花式”采集。采集深度为 0 cm20 cm 土层，挖掘时去掉地表大块沙石和其他杂物，用酒精消毒过的干净铁锹或小铲沿土壤剖面向下挖，五点混合后为一个样地的代表样品，以 1kg 左右为宜，按照 NY/Y 1121.1 中 2.2 耕层混合土样的采集中规定的“四分法”弃去多余土样，保留 300 g500
5、 g，放入无菌袋中并在袋上写清采样编号后立即放于 4 冷藏箱或者冰袋中保存，尽快运回实验室。每个采样单元不少于 10 个样地。4.4 土壤样品保存 将土样及时带回实验室后除去土壤中可见的动植物残体，一部分新鲜土样保藏于 4，在一周内完成可培养微生物数量、酶活性、微生物量碳和氮的测定，另一部分土样风干后过 2 mm 筛，用于土壤有机质含量的测定。4.5 土壤含水量和有机碳的测定 土壤含水量的测定按照NY/T 52-1987的规定进行，土壤有机碳的测定按照GB/T 33469-2016中附录C的规定进行。5 土壤微生物肥力评价项目及测定 5.1 土壤微生物肥力评价项目 土壤微生物肥力评价项目建立按
6、特尔斐法，参见附录A。具体评价项目包括微生物数量（可培养细菌数量、放线菌、真菌数量）、微生物生物量（微生物生物量碳和氮）、土壤酶活性（纤维素酶、蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶）和微生物活性（微生物熵），其中微生物熵计算如公式（1）：式中：qSMBC 微生物熵；Cmic 微生物量碳；Corg 土壤有机碳。5.2 评价项目的测定 5.2.1 微生物数量测定 土壤可培养细菌、真菌和放线菌数量采用平板计数法，按照GB 20287-2006中6.3.2的规定进行，所用培养基及其配制方法分别按照GB 20287-2006的附录A中A.1、A.6和A.7规定进行，换算成每克干土中所含的菌落数。5.2.
7、2 微生物生物量测定 土壤微生物生物量测定应按照GB/T 32723的规定进行。5.2.3 土壤酶活性测定 5.2.3.1 纤维素酶活性 纤维素酶活性测定应按照GB 20287-2006的附录D中D.1的规定进行。qSMBC=Cmic/Corg.（1）DB23/T 32372022 3 5.2.3.2 蔗糖酶活性 蔗糖酶活性以蔗糖为底物，采用 3,5-二硝基水杨酸比色法测定，具体方法按附录B中B.1的规定进行。5.2.3.3 碱性磷酸酶活性 碱性磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，具体方法按附录B中B.2的规定进行。5.2.3.4 脲酶活性 脲酶活性以尿素为底物，采取苯酚次氯酸钠比色法测定，具
8、体方法按附录B中B.3的规定进行。5.2.3.5 过氧化氢酶活性 过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法测定，具体方法按附录B中B.4的规定进行。5.2.3.6 土壤呼吸强度的测定 土壤呼吸强度测定应按照LY/T 1220的规定进行。6 黑土耕地微生物肥力评价方法 6.1 土壤微生物肥力指数模型 采用主成分分析法确定单向评价因子的权重值Ki。根据作用效应曲线，建立隶属度函数，计算各评价因子的隶属度值Ci。利用模糊数学中加权和法建立土壤微生物肥力指数模型，将所选的单个因子的评价结果转换为由各评价因子构成的土壤微生物肥力综合评价。土壤微生物肥力指数模型如公式（2）：BIF=式中：BIF 土壤微生物肥力综合指
9、数；ci 各个评价因子的隶属度值；ki 第i个评价因子的权重；n 评价因子的个数。6.2 单因素评价 6.2.1 单因素评价模型的选择 土壤可培养微生物数量、微生物生物量碳、氮、微生物熵及酶活性均属于S型隶属函数，各评价因素的隶属函数可简化为公式（3）：f(x)=式中：f(x)隶属函数；n i=1 (ki)ci.（2）1 x （3）x0 xx0 xx0 DB23/T 32372022 4 x 评价因素；x0 评价因素的上临界值。6.2.2 隶属函数阈值上限的确定 采用累积频率曲线进行确定隶属函数阈值上限，一组样本x1,x2,.xn，给定某一阈值x0，不大于x0的样本数为m，则称m/n为不大于x
10、0的累积频率，计算就得到累积频率曲线。以所有被测指标数据累积频率为75%的指标值作为隶属函数的阈值上限。6.3 评价项目的权重 参照表 1 规定的层次分析法，建立目标层、准则层（微生物数量、活性和微生物生物量）和评价项目层层次结构，构建判断矩阵。经层次单排序及其一致性检验，计算并确定所有评价项目对黑土耕地微生物肥力（目标层）相对重要性的排序权重值。表1 黑土耕地土壤微生物肥力评价因子总集 目标层 黑土耕地土壤微生物肥力评价 准则层 指标层 准则层 指标层 微生物数量指标 可培养细菌数量 土壤酶活性指标 蔗糖酶 可培养放线菌数量 纤维素酶 可培养真菌数量 脲酶 微生物生物量指标 微生物生物量碳
11、碱性磷酸酶 微生物生物量氮 过氧化氢酶 微生物活性指标 微生物熵 土壤呼吸强度 6.4 土壤微生物肥力综合评价 根据6.2.2确定的阈值上限，利用公式（3）计算各个土壤样品的隶属度值。然后应用公式（2）中所建立的土壤生物肥力指数模型，计算不同土壤样本的BIF值，其值在01之间。BIF值越大，黑土耕地微生物肥力水平越高。DB23/T 32372022 5 附录A（资料性附录）特尔斐法 A.1 特尔斐法的基本原理 该方法的核心是充分发挥一组专家对问题的各自独立看法，然后归纳、反馈，逐步收缩、集中，最终产生评价与判断。A.2 特尔斐法的基本步骤 特尔斐法的基本步骤见图1。图A.1 特尔斐法基本步骤
12、A.2.1 列出的调查提纲应当用词准确，层次分明，集中于要判断和评价的问题。为了使专家易于回答问题，通常还在提出调查提纲的同时提供有关背景材料。A.2.2 为了取得较好的评价结果，通常需要选择对问题了解校对的专家10人50人，少数重大问题可选择100人以上。A.2.3 调查结果的归纳、反馈和总结。收集到专家对问题的判断后应做统一归纳。定量判断的归纳结果通常符合正态分布。这时可在仔细听取了持极端意见专家的理由后，去掉两段各25%的意见，寻找出建议最集中的范围，然后把归纳结果反馈给专家，让专家在此提出自己的评价和判断。这样反复3次5次后，专家的意见会逐步趋近一致。这时可作出最后的分析报告。A.2.
13、4 统计参数。时常用到算数平均数和变异系数。设专家i对第j项调查的评定为Cij，则第j项评价的算数平均值为mj=Cij/n,式中n为专家总数；第j项评价的表一系数为V=Sj/mj，其中Sj为Cij的标准差，mj为均值。选择解答专家 分别征询每个专家对问题的见解 归纳统计 权重确定 反馈3 5次 最终总结分析 YES 重新赋值 意见反馈 DB23/T 32372022 6 附录B（规范性）土壤酶活性测定 B.1 土壤蔗糖酶测定 B.1.1 试剂配制 a）酶促反应试剂：基质 8%蔗糖（m:v=8:100）。b）pH 5.5 磷酸缓冲液：1/15 M 磷酸氢二钠（23.876 g Na2HPO412
14、H2O 溶于 1 L 蒸馏水中）50 mL加 1/15 M 磷酸二氢钾（9.073 g KH2PO4溶于 1 L 蒸馏水中）950 mL。c）葡萄糖标准液（1 mg/mL）：预先将分析纯葡萄糖置 80 烘箱约 12 h。准确称取 500 mg 葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至 50 mL 容量瓶中，定容，摇匀（4 保存一周）。若该溶液发生浑浊或出现絮状物，则应弃之，重新配制。d）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS 试剂）：称 2.5 g 二硝基水杨酸，溶于 100 mL 2 mol/L NaOH（20 g 定容 250 mL）和 250 mL 水中，再加 150 g 酒石酸钾钠，用水稀释定容
15、至 500 mL（棕色瓶保存，保存期不超过一周）。B.1.2 标准曲线绘制 分别吸 1 mg/mL 的葡萄糖标准液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于试管中，加 DNS 试剂 3 mL 混匀，于沸水浴中准确反应 5 min（从试管放入重新沸腾时计算起），取出立即冷水浴中冷却至室温，于50 mL 容量瓶定容后以空白管调零在波长 508 nm 处比色，以 OD 值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。B.1.3 土壤蔗糖酶测定 称取 5 g 土壤，置于 50 mL 三角瓶，注入 15 mL 蔗糖溶液，5 mL pH 5.5 磷酸缓冲液和 5 滴甲苯。摇匀混合物后（160 r
16、 震荡 10 min），放入 37 恒温箱中培养 24 h。按此操作，每一土样需做无基质对照，即用 15 mL 蒸馏水代替 15 mL 基质（8%蔗糖溶液）；整个试验需做无土壤对照，即用 5 mL 蒸馏水代替 5 g 土壤，每批土样做 2 个。培养结束后用滤纸迅速过滤。取 1 mL 滤液，注入 50 mL 容量瓶中，加 3 mL DNS 试剂，并在沸腾的水浴锅中加热 5 min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却 3 min。溶液因生成 3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至 50 mL，并在分光光度计上于 508 nm 处进行比色（如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应增加分取倍数
17、或减少培养的土样）。B.1.4 结果计算 蔗糖酶活性以 24 h、1 g 干土生成葡萄糖毫克数表示为公式（B.1）：蔗糖酶活性=（a 样品-a 无土-a 无基质）n/m 式中：a样品 由标准曲线求得的葡萄糖mg数 a无土 由标准曲线求得的葡萄糖mg数 a无基质 由标准曲线求得的葡萄糖mg数 n 分取倍数 m 烘干土重 （B.1）DB23/T 32372022 7 B.2 碱性磷酸酶 B.2.1 试剂配制 a）0.5%磷酸苯二钠（用 pH 9.4 硼酸盐缓冲液配制）；b）甲苯；c）0.3%硫酸铝溶液。d）pH 5 醋酸盐缓冲液；e）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取 0.125 g 2,6-二溴苯醌氯酰
18、亚胺，用 10 mL 96%乙醇溶解，存于棕色瓶中，放于 4 冰箱，保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。f）酚标准溶液：酚原液取 1 g 重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至 1 L，存于棕色瓶中；酚工作液取 10 mL 酚原液稀释至 1 L（每 mL 含 0.01 mg 酚）。B.2.2 酚标准曲线绘制 取 1、3、5、7、9、11 和 13 mL 酚工作液，置于 50 mL 容量瓶中，每瓶加 5 mL 缓冲液和 4 滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得 0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和 0.0026 mg/g 浓度的酚标准溶液梯度。30
19、 min 后比色测定，绘制标准曲线。B.2.3 土壤碱性磷酸酶的测定 称取 5 g 风干土置于 200 mL 三角瓶中，加 2.5 mL 甲苯，轻摇 15 min 后，加入 20 mL 0.5%磷酸苯二钠，摇匀后放入 37 恒温箱培养 24 h。培养后向培养液中加 100 mL 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取3 mL 滤液于 50 mL 容量瓶中，按绘制标准曲线所述方法显色，在分光光度计上于 660 nm 处比色。土壤碱性磷酸酶活性以 37 下 24 h 后 1 g 土壤中所释放的酚的 mg 数表示。B.3 脲酶 B.3.1 试剂配制 a）甲苯。b）10%尿素（m:v=1:10）。c）柠檬酸盐
20、缓冲液：184 g 柠檬酸和 147.5 g KOH 溶于蒸馏水。将两溶液合并，用 1 mol/L NaOH将 pH 调至 6.7，用水稀释定容至 1000 mL。d）苯酚钠溶液（1.35 mol/L）：62.5 g 苯酚溶于少量乙醇，加 2 mL 甲醇和 18.5 mL 丙酮，用乙醇稀释至 100 mL（A 液）；27 g NaOH 溶于 100 mL 水（B 液）。将 A、B 溶液保存于 4 冰箱中，使用前各取 20 mL 混合，用蒸馏水稀释至 100 mL。e）次氯酸钠溶液：用水稀释次氯酸钠试剂，至活性氯的浓度为 0.9%，溶液稳定。f）氮的标准溶液：精确称取 0.4717 g 硫酸铵溶
21、于水并稀释至 1000 mL，得到 1 mL 含有 0.1 mg 氮的标准液；再将此液稀释 10 倍（吸取 10 mL 标准液定容至 100 mL）制成氮的工作液（0.01 mg/mL）。B.3.2 标准曲线制作 分别取 0、1、3、5、7、9、11、13 mL 氮工作液，移于 50 mL 容量瓶中，然后补加蒸馏水至 20 mL。再加入 4 mL 苯酚钠溶液和 3 mL 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20 min 后显色，定容。1 h 内在分光光度计于 578 nm 波长处比色。然后以氮工作液浓度为橫坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。B.3.3 土壤脲酶的测定 DB23/T 32372022 8
22、 称取 5 g 土样于 50 mL 三角瓶中，加 1 mL 甲苯，振荡均匀，15 min 后加 10 mL 10%尿素溶液和 20 mL pH 6.7 柠檬酸盐缓冲液，摇匀后再 37 恒温箱培养 24 h。培养结束后过滤，过滤后取 1 mL 滤液加入 50 mL 容量瓶中，再加 4 mL 苯酚钠溶液和 3 mL 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20 min 后显色，定容。1 h 内在分光光度计于 578 nm 波长处比色（靛酚的蓝色在 1 h 内保持稳定）。注意事项：每个样品应做一个无基质对照，即以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同；整个实验设置一个无土对照，即不加土样，其他操作与样品实
23、验相同；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或者减少培养的土样。B.3.4 结果计算 土壤脲酶活性（Ure）以 24 h 后 1 g 土壤中 NH3-N 的 mg 数表示为公式 B.2：Ure=（a 样品-a 无土-a 无基质）Vn/m 式中：a样品 样品吸光值由标准曲线求得NH3-N的mg数 a无土 无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N的mg数 a无基质 无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N的mg数 V 显色液体积 n 分取倍数 m 烘干土重 B.4 过氧化氢酶 B.4.1 试剂配制 a）0.3%过氧化氢溶液：2.5 mL 30%过氧化氢溶液定容至 250 mL。b）
24、1.5 mol/L 硫酸溶液：42 mL 定容至 500 mL。c）饱和明矾：20 时的溶解度为 10.84 g，30 时的溶解度为 15.41 g。d）0.02 mol/L 高锰酸钾溶液：称取 3.16 g 高锰酸钾定容至 1 L，其准确浓度用标准草酸钠标定。B.4.2 测定步骤 称取土样 2.00 g 于 100 mL 塑料瓶，加 40 mL 蒸馏水，加入 50 mL 0.3%的过氧化氢溶液，200 r振荡 20 min。取下后立即加入饱和明矾 1 mL，立即过滤于盛有 5 mL 1.5 mol/L 硫酸溶液的三角瓶中，滤干后直接在 240 nm 下比色测定吸光值（As）。并做无土（A0）和无基质（Ak）对照。B.4.3 结果计算 土壤过氧化氢酶活性以 20 min 内分解的过氧化氢 mg 数表示为式 B.3：E=AeT/W，Ae=A0-As+Ak，T=CV867/（A0V0）式中：E 过氧化氢酶活性 W 土壤重 T 单位吸光度相当于过氧化氢的mg数 A0 无土对照溶液的吸光值 Ak 无基质溶液的吸光度 As 样品溶液的吸光度 C 高锰酸钾溶液的浓度（B.2）（B.3）DB23/T 32372022 9 V 吸取V0 mL的无土对照溶液用高锰酸钾滴定所消耗的高锰酸钾溶液的体积