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1、实验四PCR基因扩增及扩增产物的回收一实验目的掌握PCR扩增的原理和方法 二实验原理聚合酶链式反响（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种体外扩增特异性 DNA片段的技术。其基本原理是通过模拟体内DNA的半保存复制，利用特异的 DNA引物，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR扩增反响主要分三步：1高温变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断 裂，双链解离形成单链DNA。2低温退火：当温度突然降低到50-60C左右时， 由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反响体系中DNA引物量大大多于模 板DNA,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA
2、双链之间互补 的机会较少。3中温延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核昔三磷酸底物，以 及Mg2+存在的条件下，以引物为起始点，从5,一3傕化的DNA链延伸反响。以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一循环的模板，使产物 DNA的量按211方式扩增。理论上讲经过30次的循环反响，DNA扩增倍数为 106-109,即可使特定的基因片段成百万倍的扩增。PCR的实验操作包括模板DNA（或RNA）的制备、引物的设计合成、酶促聚 合反响、反响产物的检测等。三实验仪器、材料和方法（一）实验仪器1 PCR仪器2电泳仪3凝胶电泳槽4凝胶成像系统5恒温水浴锅6离心机（二）实验材料1模板DNA2扩增引物P!和
3、P2（三）实验试剂taq 酶1 10*taq缓冲液Mg2+4玻璃奶binding buffer5 washing buffer7TE四实验步骤1 DNA模版的制备和特异引物P1/P2的合成。2PCR体系的配置1-2 ul5 ul 3ul 4 ul 1 ul 1 ul lU/kb扩增片断 补平至50 ul模板10xNH4s04缓冲液MgS04 ()6 .5 mM dNTP Mixture 引物 Pl (10 uM) 引物 P2 (10 uM) DNA聚合酶ddH2O3PCR扩增程序设定(1) 94-96 3，-6,(2) 94 30(3) 50-6030-1,(4) 72V (按V扩增Ikb计算
4、)（5）从步骤（2）开始重复扩增29个循环(6) 72 37(7) 4-10 保存（二）PCR产物切胶回收1PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，长波紫外灯照射下切胶，称胶重2每100 mg胶加入300 uL溶胶液，55 溶胶10 min使其完全完全溶解。3将在-20。（2冻存的玻璃奶解冻，振匀，在溶解后的胶液中加入5 ul玻璃奶，吹 打均匀，55。（2沉淀lOmin,期间每分钟上下颠倒几次，12000 g离心30 s,去 上清；4沉淀中加入冰冷的500 ul稀释浓缩洗胶液（3体积浓缩洗胶液加入7体积无水 乙醇即得稀释液），吹打均匀，12000 g离心30 s,去上清，如此重复洗涤两次。5 12000 g离心60s,用枪尖吸去残留的乙醇，室温干燥10 min。6加入20ulTE或灭菌双蒸水，吹打均匀，55。（2温浴lOmin使DNA充分溶解。 12000 g离心1 min,收集上清为回收的PCR产物，-20（,C保存。7电泳检测是否回收到目的产物，以及目的产物的量。实验结果及分析本次试验中，在最后一步检测中看到了荧光，说明了 DNA的存在，证明回收到 7 PCR的产物