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1、微生物保藏及基本操作技微生物保藏及基本操作技术术医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 微生物菌种保藏微生物菌种保藏n菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。n菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。中国微生物菌种保藏管理条例医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 医疗器械无菌检验与洁净室管理技术
2、培训班，北京，2011 医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 液体石蜡法液体石蜡法n指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（斜面，再直立放置于低温（46）干燥处进行）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。保存的一种菌种保藏方法。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 v 操作步骤：操作步骤：液体石蜡预处理
3、液体石蜡预处理斜面培养物制备斜面培养物制备灌灌 注注 石石 蜡蜡保保 藏藏医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 液体石蜡法液体石蜡法v操作简单，使用比较方便；操作简单，使用比较方便；v对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；v菌种易退化、污染。菌种易退化、污染。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法n指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保
4、存方法。后保存的一种长期菌种保存方法。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 安瓿管的准备安瓿管的准备l清洗清洗l选用中性玻璃材质的安瓿管；选用中性玻璃材质的安瓿管；l2%盐酸浸泡盐酸浸泡810h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗23次；次；l置于烘箱中烘干置于烘箱中烘干。l棉塞棉塞l打棉塞，打棉塞，160定型定型2h；l标签标签l激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约1020mm。l喷码于安瓿管外，喷码于安瓿管外，160固定固定20min。l灭菌灭菌 l121，30min.医疗器械无菌检验与洁净室管理
5、技术培训班，北京，2011 保护剂的准备保护剂的准备l保护剂：保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，脱脂牛奶蒸馏水溶液，25ml/管；管；l灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113灭菌灭菌20min；l打开放气阀缓慢排出蒸汽，打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；速放入凉水中冷却；l30培养培养2天，无菌检查合格后备用。天，无菌检查合格后备用。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 n冻干样品制备冻干样品制备l制备斜面培养物；制备斜面培养物；l将将保保护护剂剂用用无无菌菌吸吸管管注注入入到
6、到斜斜面面培培养养物物上上，用用吸吸管管刮刮取取斜斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。l用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.10.2ml/管，管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。部，勿使菌液沾在管壁上。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 真空干燥真空干燥 l在在开开动动真真空空泵泵后后应应使使真真空空度度在在15min内内达达到到66.5Pa，随随后后逐逐渐渐达达到到26.613.3Pa，在在此此条
7、条件件下下，样样品品将将保保持持冻冻结结状状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。l终止干燥时间应根据下列情况判断终止干燥时间应根据下列情况判断：l安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状l真空度接近空载时的最高值真空度接近空载时的最高值l样品温度与管外温度接近样品温度与管外温度接近l选选用用12支支对对照照管管，其其水水份份与与菌菌悬悬液液同同量量，当当其其水水分分完完全全蒸蒸发发时时视视为为干干燥完结燥完结医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 预冻预冻l制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过
8、制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；l分装完成后将安瓿管立刻放入分装完成后将安瓿管立刻放入3540冰箱预冻冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；，使菌液完全冻结；l可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置20冻冻30分钟，再放入分钟，再放入80冰箱冻冰箱冻30min；l采用离心式冻干装置时勿需预冻。采用离心式冻干装置时勿需预冻。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 熔封熔封 将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；l将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封
9、；l拉管时注意火焰不要离菌体太近。拉管时注意火焰不要离菌体太近。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 真空度检测真空度检测 用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符合要求。光，说明真空度符合要求。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法v保藏、运输方便；保藏、运输方便；v保藏时间长保藏时间长(5 10年年)；v对设备要求高对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操，对人员操作水平要求高；作水平要求高；v冷冻干燥过程对菌体有损伤，需
10、恢复培养。冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011-80冰箱冻结法冰箱冻结法n将菌种悬浮于保护剂中，在将菌种悬浮于保护剂中，在8080冰箱中冻结保存的一种冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。长期菌种保藏方法。准备冷冻管准备冷冻管准备保护剂准备保护剂（10%-15%甘油）甘油）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）保藏（保藏（-80，25年）年）医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011-80冰箱冻结法冰箱冻结法v使用方便；使
11、用方便；v保藏时间较长；保藏时间较长；v对设备要求高对设备要求高(-80-80冰箱冰箱)；v运输不方便。运输不方便。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 液氮超低温冻结法液氮超低温冻结法n指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于196196的液氮或的液氮或150150左右的液氮气相中保存的一种长期菌种左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。保藏方法。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 操作步骤操作步骤l冷冻管准备冷冻管准备l保护剂制备保护剂制备l保藏培养物准备保藏培养物准备l预冻预冻 将程序降温系统预冷到将程
12、序降温系统预冷到4，将制备好的冷冻管放入其中，以，将制备好的冷冻管放入其中，以1/min降温降温速率降至速率降至-35；使用程序降温盒。使用程序降温盒。l保藏保藏 将预冻后的冷冻管转移至液氮气相将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150)或液相或液相(-196)。同同“80冰箱冻结法冰箱冻结法”医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 液氮超低温冻结法液氮超低温冻结法v保藏时间长；保藏时间长；v保藏效果好，菌种不易退化；保藏效果好，菌种不易退化；v对设备要求高对设备要求高(程控降温仪、液氮罐程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平，对人员操作水平要求高；要求高；v保藏成本高。保藏成本高
13、。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 不同保藏方法的比较不同保藏方法的比较医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 菌种保藏技术进展菌种保藏技术进展n程序降温控制技术冻结速度对菌种细胞的影响冻结速度对菌种细胞的影响冷冻速度慢冷冻速度慢：细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积收缩。冷度速度快冷度速度快：细胞内水分没有足够时间外渗，细胞内结冰。冷冻速度非常快冷冻速度非常快：细胞内冰晶非常小或称玻璃化状态。医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 v原位低温保藏技术原位低温保藏技术 有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一有些菌种不可培养，也
14、无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经被应用在一些锈菌种的保藏过程中。被应用在一些锈菌种的保藏过程中。Teliospores:Puccinia spp。Source:http:/doacs.state.fl.us/pi/enpp/pathology/images/dayl.菌种保藏技术进展菌种保藏技术进展医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 v包埋固定化技术
15、包埋固定化技术 是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取传入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，并延伸至线虫和藻类。并延伸至线虫和藻类。Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate.M.Ryan/Mycologist 15:66-69菌种保藏技术进展菌种保藏
16、技术进展医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 n玻璃化技术玻璃化技术 就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰晶，就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰晶，一下子以一下子以“非晶体非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的破坏的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的破坏作用。作用。对于对于1 1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107/107/秒时才秒时才能实现能实现“玻璃化玻璃化”。菌种保藏技术进展菌种保藏技术进展医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 保藏菌株要求保藏菌株要求药品微生
17、物检验用的试验菌应来自认可的药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内国内或国外菌种收藏机构或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株商业派生菌株。312010版中国药典药品微生物实验室规范指导原则医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 国内认可的菌种收藏机构国内认可的菌种收藏机构n1979年年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种保藏管理委员会（保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设），委员会下设7个全国性菌种保藏个全国性菌种保藏管理中心及机
18、构所在地：管理中心及机构所在地：普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）,中国科学院微生物研究所农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院 医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 国认外可的菌种收藏机构国认外可的菌种收藏机构n世界菌种保藏联合会世界菌种保藏联合会WFC
19、C(World Federation Of Culture Collection)全球注册的菌种保藏机构全球注册的菌种保藏机构583家家ATCCNRRLDSMZNCTCCMICBSNBRC(IFO)JCM医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 菌株代数 美国药典（美国药典（USPUSP）中规定：）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次内，每萌发一次即称为一代，即称为一代，”并规定并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5 5代代”。United States Pharmacopo
20、eia(USP)provides that:to microbial inoculation to a fresh medium on/in each germination time is referred to as a generation,and provides that strains of the passages(from the original strain from freeze-dried powder)must not exceed 5 generation.“我国的我国的GMPGMP认证中也如此要求，并且中国药典认证中也如此要求，并且中国药典20052005年版药典
21、也已做出年版药典也已做出“菌种的菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5 5代代”这个明确的规定。这个明确的规定。Chinas GMP certification is asking,and the Chinese Pharmacopoeia 2005 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages(from the original strain from freeze-dried powder)should not exceed 5 on behalf of The clear
22、ly defined.Enrichment(G1)Separation of single-olony(G2)Working strain(W3)Working strain(W4)Working strain(W5)医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 标准菌株提供形式标准菌株提供形式AccuracyAccuracyEasy of UseEasy of Use(preparation)(preparation)HighHighLowLowComplicatedComplicatedEasyEasyQuanti Cult Quanti Cult(REMEL)(REMEL)St
23、andard Strains Standard Strains(ATCC/NBRC etc.)(ATCC/NBRC etc.)EZ-CFU one step EZ-CFU one step(MicroBioLogics)(MicroBioLogics)KWIK-STIK KWIK-STIK(MicroBioLogics)(MicroBioLogics)Culti Loops Culti Loops(REMEL)(REMEL)BioBall BioBall(BTF/bioMerieux)(BTF/bioMerieux)医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011 n参考菌株参考菌株 Primary strainQualitative strainQuantitative strain