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1、微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC姚粟姚粟医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物菌种保藏微生物菌种保藏n菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。n菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。 中国微生物菌种保藏管理条例医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物菌种保藏微生物菌种保藏n制订专门菌种保藏管理制度；制订专门
2、菌种保藏管理制度；n同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；n对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；藏设备中； n对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理； n设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物菌种保藏微生物菌种保藏n微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休
3、眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 常用菌种保藏方法常用菌种保藏方法n定期移植法定期移植法n液体石蜡法液体石蜡法n真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法n-80低温冻结法低温冻结法n液氮超低温冻结法液氮超低温冻结法医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 定期移植法定期移植法n亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于面培养基上，最适条件下培养，完成培养于46进行保存并间隔一定时间（进行保存并间隔一定时间（3-6
4、3-6个月）进行移个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。植培养的一种短期菌种保藏方法。n操作步骤：操作步骤： 斜面制备斜面制备 接种接种 培养培养 保藏保藏医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 v 接接 种种医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 定期移植法定期移植法v操作简单，使用方便；操作简单，使用方便；v对设备和人员要求不高；对设备和人员要求不高；v可随时使用，便于观察菌种；可随时使用，便于观察菌种；v工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；v菌种传代频繁，易退化、污染。菌种传代频繁，易退化、污染。医疗器械无菌
5、检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液体石蜡法液体石蜡法n指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（斜面，再直立放置于低温（46）干燥处进行）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。保存的一种菌种保藏方法。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 v 操作步骤：操作步骤：液体石蜡预处理液体石蜡预处理斜面培养物制备斜面培养物制备灌灌 注注 石石 蜡蜡保保 藏藏医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液体石蜡法液体石蜡
6、法v操作简单，使用比较方便；操作简单，使用比较方便；v对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；v菌种易退化、污染。菌种易退化、污染。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法n指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。后保存的一种长期菌种保存方法。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 安瓿管的准备安瓿管的准备l清洗清洗l选用中性玻璃材质的
7、安瓿管；选用中性玻璃材质的安瓿管；l2%盐酸浸泡盐酸浸泡810h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗23次；次；l置于烘箱中烘干置于烘箱中烘干。l棉塞棉塞l打棉塞，打棉塞，160定型定型2h；l标签标签l激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约1020mm。l喷码于安瓿管外，喷码于安瓿管外，160固定固定20min。l灭菌灭菌 l121 ，30min.医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 保护剂的准备保护剂的准备l保护剂：保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，脱脂牛奶蒸馏水溶液，25ml/管；管；l灭菌锅加热
8、至沸腾，将牛奶管放入锅中，灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113灭菌灭菌20min；l打开放气阀缓慢排出蒸汽，打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；速放入凉水中冷却；l30培养培养2天，无菌检查合格后备用。天，无菌检查合格后备用。 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n冻干样品制备冻干样品制备l制备斜面培养物；制备斜面培养物；l将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。l用长毛细
9、滴管将菌悬液分装到安瓿管内，用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.10.2ml/管，管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。部，勿使菌液沾在管壁上。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 真空干燥真空干燥 l在开动真空泵后应使真空度在在开动真空泵后应使真空度在15min内达到内达到66.5Pa，随后，随后逐渐达到逐渐达到26.613.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。l终
10、止干燥时间应根据下列情况判断终止干燥时间应根据下列情况判断：l安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状l真空度接近空载时的最高值真空度接近空载时的最高值l样品温度与管外温度接近样品温度与管外温度接近l选用选用12支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结干燥完结医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 预冻预冻l制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；l分装完成后将安瓿管立刻放入分装完成后将安瓿管立刻放入3540冰箱预冻冰箱预冻1
11、h，使菌液完全冻结；使菌液完全冻结；l可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置20冻冻30分钟，再放入分钟，再放入80冰箱冻冰箱冻30min；l采用离心式冻干装置时勿需预冻。采用离心式冻干装置时勿需预冻。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 熔封熔封 将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；l将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；l拉管时注意火焰不要离菌体太近。拉管时注意火焰不要离菌体太近。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 真空度检测真空
12、度检测 用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符合要求。光，说明真空度符合要求。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法v保藏、运输方便；保藏、运输方便；v保藏时间长保藏时间长(5 10年年)；v对设备要求高对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操，对人员操作水平要求高；作水平要求高；v冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n将菌种悬浮于保护剂中，在将菌
13、种悬浮于保护剂中，在8080冰箱中冻结保存的一种冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。长期菌种保藏方法。准备冷冻管准备冷冻管准备保护剂准备保护剂 （ 10%-15%甘油）甘油）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）保藏（保藏（ -80，25年）年）医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 v使用方便；使用方便；v保藏时间较长；保藏时间较长；v对设备要求高对设备要求高(-80-80冰箱冰箱)；v运输不方便。运输不方便。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液氮
14、超低温冻结法液氮超低温冻结法n指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于196196的液氮或的液氮或150150左右的液氮气相中保存的一种长期菌种左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。保藏方法。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 操作步骤操作步骤l冷冻管准备冷冻管准备l保护剂制备保护剂制备l保藏培养物准备保藏培养物准备l预冻预冻 将程序降温系统预冷到将程序降温系统预冷到4，将制备好的冷冻管放入其中，以，将制备好的冷冻管放入其中，以1/min降温降温速率降至速率降至-35； 使用程序降温盒。使用程序降温盒。l保藏保藏 将预冻后的
15、冷冻管转移至液氮气相将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150)或液相或液相(-196)。同同“80冰箱冻结法冰箱冻结法”医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液氮超低温冻结法液氮超低温冻结法v保藏时间长；保藏时间长；v保藏效果好，菌种不易退化；保藏效果好，菌种不易退化；v对设备要求高对设备要求高(程控降温仪、液氮罐程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平，对人员操作水平要求高；要求高；v保藏成本高。保藏成本高。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 不同保藏方法的比较不同保藏方法的比较医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 菌种保藏技术进展菌种保藏
16、技术进展n程序降温控制技术冻结速度对菌种细胞的影响冻结速度对菌种细胞的影响冷冻速度慢冷冻速度慢：细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积收缩。冷度速度快冷度速度快：细胞内水分没有足够时间外渗，细胞内结冰。冷冻速度非常快冷冻速度非常快：细胞内冰晶非常小或称玻璃化状态。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 v原位低温保藏技术原位低温保藏技术 有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌根真菌）等。这些菌种可采用
17、原位低温保藏技术，这一技术已经根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经被应用在一些锈菌种的保藏过程中。被应用在一些锈菌种的保藏过程中。Teliospores : Puccinia spp。Source: http:/doacs.state.fl.us/pi/enpp/pathology/images/dayl.菌种保藏技术进展菌种保藏技术进展医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 v包埋固定化技术包埋固定化技术 是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一
18、旦固定化，便可采取传入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，并延伸至线虫和藻类。并延伸至线虫和藻类。Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate. M.Ryan / Mycologist 15: 66-69菌种保藏技术进展菌种保藏技术进展医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n玻璃化技术玻璃化技术 就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰晶，就是用极快的冷
19、却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰晶，一下子以一下子以“非晶体非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的破坏的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的破坏作用。作用。 对于对于1 1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107/107/秒时才秒时才能实现能实现“玻璃化玻璃化”。 菌种保藏技术进展菌种保藏技术进展医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 标准菌株要求标准菌株要求药品微生物检验用的试验菌应来自认可的药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内国内或国外菌种收藏机构或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标的标准菌株，或使用与标准菌
20、株所有相关特性等效的准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株商业派生菌株。312010版中国药典药品微生物实验室规范指导原则医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 国内认可的菌种收藏机构国内认可的菌种收藏机构n1979年年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种保藏管理委员会（保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设），委员会下设7个全国性菌种保藏个全国性菌种保藏管理中心及机构所在地：管理中心及机构所在地：普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）, 中国科学院微生物研究所农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所工
21、业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 国认外可的菌种收藏机构国认外可的菌种收藏机构n世界菌种保藏联合会世界菌种保藏联合会WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注册的菌种保藏机构全球注册的菌种保藏机构583家家ATCCNRRL
22、DSMZNCTCCMICBSNBRC(IFO)JCM医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 AccuracyAccuracyEasy of UseEasy of Use(preparation)(preparation)HighHighLowLowComplicatedComplicatedEasyEasyQuanti Cult Quanti Cult (REMEL)(REMEL)Standard Strains Standard Strains (ATCC/NBRC etc.)(ATCC/NBRC etc.)EZ-CFU one step EZ-CFU one step (MicroBioLogics)(MicroBioLogics)KWIK-STIK KWIK-STIK (MicroBioLogics)(MicroBioLogics)Culti Loops Culti Loops (REMEL)(REMEL)BioBall BioBall (BTF/bioMerieux)(BTF/bioMerieux)医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n参考菌株参考菌株 Primary strainQualitative strainQuantitative strain