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1、第一章发酵工程概述（一）发酵工程：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品,或直接把微生物应用于工业生产过程中的一种新技术。1、发酵工程的内容：菌种的选育一培养基的配制一灭菌一扩大培养和接种一发酵过程一别离提纯； 2,发酵历史：天然发酵阶段、纯培养技术的建立、通气搅拌发酵技术、代谢发酵控制技术、开拓发 酵新原料、基因工程阶段；3、流程：菌种、活化、扩大、种子、发酵、别离、产品；4、发酵工业的分类：厌氧和有氧发酵；液体和固体发酵；分批和连续发酵；5、微生物发酵的基本特征：微生物发酵过程是一个典型的化工过程；微生物发酵过程是一个典型的代谢控制发酵（代谢控制发酵是指利用生
2、 物的、物里的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代 谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程）微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业，有以下几个特 征：反响条件温和与非连续性生产；，6、转基因产品：是指利用基因工程技术将一种微生物、动物或植物的基因植入另一种微生物、动物 或植物中，改变原有生物的基因组，制造出具备新特征的产品，从而使该产品获得 它所不能自然拥有的品质。方法：用一定的方法将所需要的目的DNA片段从某一生物供体中克隆出来；在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，形成 重组的DNA分子；将重组的DNA分子转移到受体微生物中；最
3、后经过筛选可得到重组了外源DNA分子的微生物，这就是转基因微生物。7、发酵液的别离技术：发酵液的预处理：一，改变发酵液的过滤和沉降特性二，发酵液的相对纯化发酵醪与菌体的别离（固液别离）技术：一，过滤别离技术二，离心别离技术三，其他固液别离技术细胞破碎技术：一，物理破碎技术（包括：高速珠磨破碎技术；高压均质破碎技术；超声波 破碎技术等）二，化学破碎技术（包括：酸热技术；化学渗透技术等）三，生物酶溶技术四，其他破碎技术五，细胞破碎率的测定与破碎技术的开展方向发酵产物的提取技术：一.沉淀提取技术（包括：有机溶剂沉淀技术；盐析沉淀技术；等电点 沉淀技术；金属离子沉淀技术；聚电解质沉淀技术； 非离子型聚
4、合物沉淀技术等）二.吸附提取技术（包括：活性碳疏水性吸附技术；硅胶、氧化铝等 亲水性吸附技术；树脂吸附技术）三.萃取技术、电泳别离一等电、毛细（包括：有机溶剂萃取技术； 双水相萃取技术；反胶束萃取技术；液膜萃取技术； 液固萃取一一浸取技术；超临界流体萃取技术）四.蒸储技术发酵产物的精制技术：一.色谱技术（包括：凝胶层析色谱技术；离子交换色谱技术；吸附 色谱技术；分配色谱技术；亲和色谱技术；逆流色谱技 术等）（1）在气泡与包围着气泡的液体之间存在着界面，在界面的气泡一侧存在着一层气膜，在界面的 液体一侧存在着一层液膜。气膜内的气体分子和液膜中的液体分子和液膜中的液体分子都处于 层流状态，分子间无
5、对流运动，因此氧的分子只能以扩散方式，即籍浓度差而透过双膜；另外，气泡内除开气膜以外的气体分子，处于对流状态，称为气体主流，在空气主流空 间的任一点，氧分子的浓度相同，液体主流中也是如此（2）在双膜之间的界面上，氧气的分压强与溶于液体中的氧的浓度（3）传质过程处于稳定状态，传质途径上各点的氧的浓度不随时间而变。氧气的溶解过程是一个由气相进入液相的过程，为实现这一过程，氧气需要跨过由气液界面构 成的屏障，在界面的一侧有气膜，另一侧为液膜，氧的溶解需要经过这两层膜才能实现。因此，根 据这一模型建立起来的气体溶解理论称为双膜理论。5、氧传递的动力和阻力：传递过程的总推动力是气相与细胞内的氧分压之差；
6、气液相间的氧传递阻力：气膜和液膜中；液固相间的氧传递：细胞或细胞周围的液膜阻力可忽略；6、影响氧溶解效果（体积溶氧系数）的因素：发酵罐结构如高径比、挡板安置情况、罐内压与发酵液 深度、搅拌器型式、搅拌转速、通风量、培养基组成；机械搅拌：将通入的空气打碎成细泡，增加了气液接触面积；小气泡从罐底上升到液面的速度要比大气泡慢，这又使气液接触的时间增加；气泡不是直线上升而是成螺旋线上升；液体呈湍流运动因而减少了气泡周围的液膜厚度，增加了氧扩散到液体中的速度；外表活性剂增大传递阻力，使溶氧降低；注：对数生长初期，比耗氧速率到达最大值，但此时细胞浓度低，摄氧率并不高。随着细胞浓度 的迅速增高，培养液的摄氧
7、率增高，在对数生长后期到达峰值；7、引起溶氧异常下降的原因：污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗菌体代谢发生异常，需氧要求增加某些设备或工艺控制发生故障或变化，如搅拌功率消耗变小或搅拌 速度变慢；消泡剂加入过多影响供氧的工艺操作如停止搅拌、闷罐等引起溶氧异常升高的原因：主要是耗氧出现改变，如菌体代谢异常，耗氧能力下降 污染烈性噬菌体供氧控制：设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数Kia值；8、测量体积溶氧系数的方法：亚硫酸盐氧化法：用铜离子作为催化剂，溶解在水中的氧能立即氧化其中的亚硫酸根离子，使 之成为硫酸根离子溶氧电极法：复膜电极法：分为极谱型和原电池型；（主要由两个金属电极、电解质、塑料薄
8、膜组成） 极谱型需加一定外界电压，而原电池型不需外界加电压；阴极：02 + 2H2。+ 4e 40H-；阳极：Pb - 2e Pb+;可在发酵过程中测定溶氧、耗氧速率等，目前较常用的方法；极谱法：溶液加入0.8V的电压时，阴极溶解氧发生氧化还原反响被消耗，因此阴极外表和溶 液主体间存在一个氧的浓度差，溶解氧扩散到阴极参加反响，形成扩散电流；第六章谷氨酸的提取（-）别离的基础：挥发性、结晶性、成盐性、络合性、溶解性、空间结构、絮凝性、电荷性、吸附 性b原那么：简单、方便、收率高、纯度高、造价低、本钱低2,通例：离心6000T0000r/ni别离菌体（可以加聚丙烯酰胺助凝）-一过滤除杂-60减压浓
9、缩含量1520%硫酸调pH3. 2搅拌-连续冷5-10 却结晶（溶解度0. 4g/100ml（二）结晶：溶质分子有规那么的排列而结合成结晶，通常同类分子才可能排列为结晶，这一过程有 很好的选择性。（结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出形成新相的过程）1,饱和溶液的形成：蒸发、温度诱导、盐析结晶、透析结晶、有机溶剂结晶法、等电点法、微量扩 散法、化学反响结晶法、共沸蒸储结晶2,谷氨酸结晶的性质：a一结晶一六方晶体-纯度高、颗粒大、制两重、易别离、比重0.85；B一结晶-粉状、针状、鳞片状、比重0.45；影响结晶因素：过饱和率、黏度、温度、搅拌、晶种、PH和等电点等；3,结晶是制备纯物质的有效方法。
10、结晶过程具有高度的选择性、只有同类分子或离子才能结合为晶 体。晶体系化学性均一得固体，具有一定规那么的晶形，是以分子、离子或原子在空间晶格的空 间点上的对称排列为特征。4、结晶过程：过饱和溶液一一晶核形成一一晶体生长；工业发酵常用的结晶设备：间歇式和连续式两类；5、区别一个物质是晶态还是非晶态：晶体的许多性质具有方向性和向量性（晶体的各向异性）； 第七章酒精的蒸储蒸储：将酒精和其它挥发性物质从酒醋中提取出来，并排除杂质的过程；（蒸储可使其各组分之间得 到提纯和重新分配）（一）基本理论b假设将两种或两种以上挥发性不同的物质组成的混合溶液加热至沸腾，这时液相组分与气相组分往 往不同，气相比液相含有
11、较多的易挥发组分，剩下的液相就含有较多难挥发组分。拉乌尔定律：混合溶液中的蒸汽压高（沸点低）的组分在汽相中含量，总是比液相中高；亨利定律：在一定的温度下，气体在液体中的溶解度和该气体的平衡分压成正比；2,挥发系数K=A/Q （K表示乙醇在该溶液中的挥发性能强弱；K=1时，溶液中酒精浓度与蒸汽中 酒精浓度相等，此时的沸点为78.15C,这时的沸点称之为最低恒沸点，该组分 的混合物称恒沸混合物）3,无水酒精制备：1、低温固体吸附一氧化钙、分子筛一沸石吸附3/4的水、1/4酒精2、液体吸附剂一-甘油、汽油3、共沸吸水-苏联苯、美国环己烷、戊烷4、共沸点盐移位一-氯化钙、醋酸钾一-10%CaC12共沸
12、点消失5、真空脱水6、有机物吸附-玉米粉、玉米淀粉一易于重复回收一发酵7、蒸僧、膜别离、离子交换一钾型强酸树脂4,蒸储分类：壶式蒸储：夏朗德蒸播法包括两次蒸储。首先蒸储葡萄原酒，以获得低度酒；然后再 用低度酒蒸镯，以获得白兰地。固态蒸储第八章发酵设备反响器分类：槽形反响器：主要用于进行液相均相、液相非均相或气液相反响。可间歇操作，也可 连续操作。管式反响器：应用于气相或液相连续反响；塔式反响器：应用于气-液反响和液-液反响；固定床反响器：流体通过静态催化剂颗粒进行反响的反响器流化床反响器：固体在反响器内处于流化状态，主要用于气-固相催化反响；（-）发酵设备概述（发酵主要设备为发酵罐和种子罐）种
13、子罐：以确保发酵罐培养所必需的菌体量为目的发酵罐：承当产物的生产任务1、发酵罐系统：应具有严密的结构良好的液体混合特性好的传质相传热速率具有配套而又可靠的检测、控制仪表2、发酵罐的特点：具有严密性，运行的高度可靠性发酵罐更加趋向大型化和自动化开展3、发酵罐种类：通风搅拌罐、气提式发酵罐、压力循环发酵罐、带超滤膜的发酵罐等；4、发酵罐类型：按微生物生长代谢需要分类：好气和厌气；按照发酵罐设备特点分类：机械搅拌通风发酵罐非机械搅拌通风发酵罐按容积分类：500L以下的是实验室发酵罐500-5000L是中试发酵罐5000L以上是生产规模发酵罐（二）嫌气发酵设备1、密闭厌氧发酵罐：能封闭；能承受一定压力
14、；有冷却设备；罐内尽量减少装置，消灭死角，便于 清洗灭菌。（酒精和啤酒）酒精发酵罐：酒精发酵罐的洗涤一一水力喷射洗涤装置；啤酒发酵设备：分为前发酵设备和后发酵设备；酵母将糖转化为酒精高转化率条件：满足酵母生长和代谢的必要工艺条件；一定的生化反响时间；及时移走在生化反响过程中将释放的生物热；发酵的冷却装置：中小型发酵罐一一罐顶喷水淋于罐外壁外表进行膜状冷却；大型发酵罐一一罐内装冷却蛇管或罐内蛇管和罐外壁喷洒联合冷却装置；密闭式发酵槽优点：可回收二氧化碳减少前发酵室内通风换气的耗冷量减少杂菌污染机会2、新型啤酒发酵设备：圆筒体锥底发酵耀：优点一一加速发酵、厂房投资节省、冷耗节省、发酵罐清洗、消毒自
15、动化;联合罐：是一种具有较浅锥底的大直径（高径比为1： 11. 3）发酵罐；能在罐内进行机械搅拌，并具有冷却装置；朝日罐：前发酵和后发酵合一的室外大型发酵罐特点：利用离心机回收酵母利用薄板换热器控制发酵温度利用循环泵把发酵液抽出又送回去大型发酵罐的设计：罐的耐压要求、热交换、内部清洗；（三）通风发酵罐1、机械搅拌发酵罐：利用机械搅拌器的作用，使空气和醪液充分混合促使氧在醪液中溶解，以保证 供给微生物生长繁殖、发酵所需要的氧气2、发酵罐的基本条件：发酵罐应具有适宜的径高比发酵罐能承受一定的压力要保证发酵液必须的溶解氧发酵罐应具有足够的冷却面积发酵罐内应尽量减少死角，防止藏垢积污，灭菌能彻底，防止
16、染菌搅拌器的轴封应严密，防病量减少泄漏3、发酵罐的结构：罐体搅拌器和挡板：搅拌器有平叶式、弯叶式、箭叶式三种，其作用是打碎气泡，使 氧溶解于醪液中；挡板的作用是改变液流的方向；消泡器：加入化学消泡剂消除泡沫和机械消泡；联轴器及轴承变速装置空气分布装置：作用是吹入无菌空气，并使空气均匀分布；轴封：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄露和污染杂菌；冷却装置4、自吸式发酵罐与通用发酵罐的主要区别：有一个特殊的搅拌器，由转子和定子组成； 没有通气管；5、带升式发酵罐：不用机械搅拌，借通风起到搅拌作用并供给氧气；（四）固体发酵设备1、固体发酵：微生物在具有一定温度和湿度的固体外表进行生长和繁殖就称
17、作为固体发酵；2、固体发酵的优点：原料来源广，价格低廉在霉菌发酵时就可以防止污染杂菌能耗低固体发酵的产物回收一般步骤少，费用也省缺点：大规模生产时的散热比拟困难，参数检测如pH值、温度、菌体增殖量、产物 生成量等是很难实现的3、固体发酵设备按照固体培养方式来区分：浅盘式、旋转式、厚层式、发酵池；第九章 发酵动力学（一）微生物反响过程概论1、微生物反响过程的主要特征：微生物是该反响过程的主体；微生物反响的本质是复杂的酶催化反响体系；2、微生物反响动力学的描述方法：细胞生长动力学反响基质消耗动力学代谢产物生成动力学发酵过程：包括细胞内的生化反响，胞内与胞外的物质交换，胞 外物质传递及反响；发酵过程
18、特点：多相一一气相、液相和固相；多组分；非线性描述困难一一细胞代谢过程用非线 性方程描述；复杂群体的生命活动；3、发酵动力学：是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律； 研究内容：包括了发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系，环境因 素对三者的影响，以及影响其反响速度的条件研究发酵动力学的目的：确定最正确发酵工艺条件建立发酵过程中菌体浓度、基质浓度、温度、pH、溶氧等工艺参数的控 制方案可在此研究基础上进行优选（二）发酵动力学分类1、根据细胞生长与产物形成有否偶联进行分类：生长产物合成偶联型（I型）：产物的形成与生长是平行的；（葡萄糖代谢的初级中
19、间产物）生长与产物合成非偶联类型（HI型）：产物的合成是在菌体的浓度接近或到达最高之后才开 始的；（各种抗生素、毒素等）生长与产物合成半偶联类型（H型）：中间类型；（乳酸发酵）2、根据产物形成与基质消耗的关系分类：类型I ：产物的形成直接与基质（糖类）的消耗有关；类型n：产物的形成间接与基质（糖类）的消耗有关；（柠檬酸、谷氨酸发酵）类型山：产物的形成显然与基质（糖类）的消耗无关；（抗生素等）3、根据反响形式分类：简单反响型：营养成分以固定的化学量转化为产物，没有中间物积聚。又可分为有生长偶 联和无生长偶联两类。并行反响型：营养成分以不定的化学量转化为产物，在反响过程中产生一种以上的产物， 而且
20、这些产物的生成速率随营养成分的浓度而异，同时没有中间物积聚。串联反响型：是指在形成产物之前积累一定程度的中间物的反响。分段反响型：其营养成分在转化为产物之前全部转变为中间物，或营养成分以优先顺序选 择性地转化为产物。反响过程是由两个简单反响段组成，这两段反响由酶诱 导调节。复合型：大多数发酵过程是一个联合反响，它们的联合可能相当复杂（三）微生物生长动力学微生物培养过程根据培养条件要求分为好氧培养和厌氧培养；好氧发酵有液体外表培养，在多 孔或颗粒状固体培养基外表上培养和通氧深层培养几种方法；厌氧发酵采用不通氧的深层培养1、分批发酵法：底物一次装入罐内，在适宜条件下接种进行反响，经过一定时间后将全
21、部反响系取 出分批发酵特点：细菌生长曲线可分为调整期、对数生长期、平衡期和衰亡期四个阶段 研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛的对数生长期细胞补料分批发酵法：优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度；2、连续发酵法（使菌体维持在衡定生长速度下进行连续生长和发酵）：反响开始后，一方面把底物 连续地供给到反响器中，另一方面又把反响液连续不断地取出，使反响条件不随时间变化 连续发酵的优点：缩短发酵周期，提高劳动生产率；自动化控制；产品质量较稳定生长与代谢产物形成的两种类型节约了大量动力、人力等，使水、汽、电的负 荷均匀合理连续发酵的缺点：菌种易于退化；易遭杂菌污染；营养物的利用率低；3、半分批式操作：
22、先将一定量底物装入罐内，在适宜条件下接种使反响开始。反响过程中，将特定 的限制性底物送人反响器，以控制罐内限制性底物浓度保持一定，反响终止取出反响系 4、反复分批式操作：分批操作完成后取出局部反响系，剩余局部重新加入底物，再按分批式操作进 行5、反复半分批式操作：流加操作完成后，取出局部反响系，剩余局部重新加入一定量底物，再按流 加式操作进行（四）微生物生长的测定：通常是测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量或大小；1、计数法：血球计数板：一定的容积中的微生物的个体数目，包括死活细胞。适合个体较大的菌体 或胞子；浊度计比浊法：测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数量的生长；2、测定细胞
23、重量：细胞干重称量法：直接测定单位体积培养物的细胞干重细胞堆积容积测量法：用刻度锥形管测量经离心的细胞沉淀物的容积，由此间 接表示细胞重量细胞组成分析法：测定一种大分子的细胞组成（如蛋白质、RNA、DNA等），间接 算出细胞的重量营养物消耗分析法：测定培养基中不用于合成代谢产物的营养物（磷酸盐、硫酸 盐等）的消耗，由此间接表示生长的细胞重量产物重量分析法：测定培养中间形成的二氧化碳，氢，ATP等产物，由此间接换 算出生长的细胞重量；二.膜技术（包括：透析技术；电渗析技术；微滤技术；超滤技术； 反渗透技术；渗透气化技术；纳米过滤技术等）发酵产物的成品加工技术：一.浓缩技术（包括：蒸发浓缩技术；冷
24、冻浓缩技术；吸收浓缩 技术等）二.结晶技术（包括：添加晶种结晶技术；溶媒蒸发结晶技术； 添加有机溶剂结晶技术；盐析结晶技术；等电点结 晶技术等）三.干燥技术（包括：气流干燥技术；沸腾干燥技术；喷雾干燥 技术；真空干燥技术；真空冷冻升华干燥技术等） 第二章发酵菌种选育（一）工业化菌种的要求：（1）所需培养基易得，价格低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反响速度较快，发酵周期短（4）单产高（选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）（5）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素
25、、激素和毒素）；工业常用菌种：大肠杆菌、乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌等；（二）菌种的别离b菌种来源：购买或从自然界别离筛选；2,菌种别离过程：采样（以采集土壤为主，取离地面5-15cm处的土约10g）增殖培养（通过配制选择性培养基）培养别离（划线别离法、稀释别离法）筛选毒性实验（三）培养别离1,自然界细菌的别离：采样和采集方法采样一一采样时应尽可能保持相对无菌；所采集的样本必须具有某种代表性；应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是 因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境， 其
26、内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长采集方法一一土样采集方法（采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中）植物体采集方法水样采集方法（较深的静水层中采集水样）2,对某些少数细菌那么要求特殊的富集或选择技术才能很好地被别离培养：富集方法：运用细菌的酶诱导性，激活细菌某一特殊基因组，如添加抗生素、复杂底物及生长 因子的前体物质来，富集可以促进抗性的产生并维持下来土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1ml涂布已添加及未添加富集底物（如几丁质、纤维素 等）的土浸出汁平板。植物体上细菌的别离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后 涂布平板。水中细菌的别离：水样通过0.2
27、2 uni无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积 洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印别离法。次代培养及纯化；3,低碳/氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，别离和鉴定（四）工业菌种的育种（是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方 位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状）1,方法：诱变、基因转移、基因重组2,育种过程：（1）在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。（2）希望基因型的选出。（3）改良菌种的评价（包括实验规模和工业生产规模）考虑因素：改良方法、基因表达、生长效率3,诱变育种：以诱发突变
28、为基础的育种，是目前国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变剂：物理诱变一一射线如紫外线、X一射线、丫一射线，快中子；化学诱变剂一一化学因子如碱基类似物、5一氟尿喀咤、烷化剂等。化学诱变剂中使 用最多、最有效的是烷化剂。诱变处理：不同种类采用不同的方法；（五）营养缺陷型的选育1,营养缺陷型：通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须 在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株；2,能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基3,筛选营养缺陷型的步骤：诱变（物理和化学诱变
29、）淘汰野生型：抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能；菌丝过滤法：对于霉菌，因徇子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将 菌丝滤去，而缺陷型抱子却因未发芽而不能滤过；检出缺陷型：原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM 上生长良好，而在MM上那么不生长，野生型都能生长；具体方法：影印法、点种法、夹层法；确定生长谱：验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子4,代谢调控的类型诱导或叫去阻遏：在缺乏底物时，编码这些酶的基因处于非转录状态，酶的合成受阻。（水解 酶、青霉素酶、半乳糖昔酶）突变可以消除酶合成对诱导物的依赖，这种突变称之为“组成型”突变。碳分解代谢产物调节
30、：是分解代谢产物调节最普遍的模式-一分解代谢产物阻遏。氮分解代谢产物调节：许多含氮底物酶受氨或可快速利用的氨基酸的调节（固氮酶）。磷、硫的调节：抗生素只有在磷酸盐含量控制在生长的“亚适量”时才能合成。反响调节：降解酶通常受到诱导和分解代谢物调节的控制，合成酶主要受反响调节的控制。5,初级代谢产物的调节：降低终产物浓度；筛选获得抗性植株；某些初级代谢产物可以调节次级代谢产物的合成的原因：有一条共同的合成途径，当初级代谢产物积累时,反响抑制了某一步反响的进行,而最终抑 制了次级代谢产物的合成。初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成，反响抑制了它自身的合成时，必然也同 时影响了次级代谢产物的合成
31、。（六）基因育种基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其 他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或 者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另一个细 胞的方法。过程：获得目的基因一一目的基因与载体连接一一导入宿主细胞一一筛选、鉴定阳性重组子一一重 组子的扩增或表达；1、基因重组：载体的条件：能在宿主细胞中复制；具有多种限制酶的单一切点；具有筛选标志；载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于别离；表达型载体还应具有启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；宿
32、主的条件：对载体的复制和扩增没有严格的限制；不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；重组缺陷型，不会产生体内重组；容易导入重组DNA分子；符合重组DNA操作的平安标准；质粒DNA的提取方法：细菌培养和质粒扩增；细菌的收获和裂解；质粒DNA的提取2、重组DNA中常用的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、连接酶、 修补工具酶、末端加工酶、末端转移酶、反转录酶；3、目的基因的获取：通过建立基因文库（基因组文库和cDNA）别离靶基因化学合成法制备DNA片段聚合酶链反响法扩增基因片段4、遗传转化：受体细胞直接摄取供体细胞游离的DNA片段
33、，将其同源局部进行碱基配对，组合到自 己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状。常用的遗传转化系统：自然系统人工诱导（完整细胞）：二价阳离子系统、单价阳离子系统、冻融系统、 Triton 处理；5、转化：细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。（细菌经处理使之处于感受态；有电 穿孔法等）导入受体的方式：感染一一在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。转染一一在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进 受体菌。6、重组克隆的筛选与鉴定：抗药性标志的筛选（lacZ基因）：如果克隆载体带有某种抗药性标志基因，转化后只有含 这种抗药基因的转化子细菌才能在含
34、该抗菌素的平板上幸存并形成菌落；菌落快速裂解鉴定法：从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断 有无插入片段存在；内切酶图谱鉴定：经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再别离出重组质粒或重组噬 菌体DNA,用相应的内切酶切割，释放出插入片断（七）工业微生物菌种保藏技术1、理想的菌种保藏方法应具备的条件：经长期保藏后菌种存活健在；保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级和次级代谢产物生产的高产能力；菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空；2、工业微生物菌种保藏技术：冷冻干燥或真空干燥保藏（保藏微生物菌种的最简单而有效的方法、冷冻保护剂）分为普通冷冻保藏技术（-20）；超低
35、温冷冻保藏技术（-60 80）；液氮冷冻保藏技术超低温或在液氮中冷冻保藏、升华干燥保藏转接培养或斜面传代保藏土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏（最为简单和经济，但易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变） 3、防止菌种退化的措施：菌种退化的原因有两方面：一、菌种保藏不妥；二、菌种生长的要求没有得到满足；如果发现菌株已经发生退化，产量下降，那么要进行别离复壮。（单细胞菌株别离）某些菌株进行单细胞别离仍不能到达复壮效果，那么可改变培养条件。产生退化现象的原因多为基因突变，使用诱变剂处理，对退化类型的菌株具有杀伤力，再进行 单菌落别离，就可得到复壮的菌株。第三章种子的扩大培养（-）种子扩大培养：是指将保存在砂土
36、管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活 化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过 程。这些纯种培养物称为种子。1、种子扩大培养的任务：不但要得到纯而壮的培养物，且要获得活力旺盛的，接种数足够的培养物。2、种子扩培的目的：接种量的需要、菌种的驯化、缩短发酵时间、保证生产水平；3、种子的要求：总量及浓度能满足要求生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染4、种子制备过程举例：谷氨酸生产的种子制备：斜面菌种一一级种子培养一二级种子培养一发酵青霉素生产的种子制备：安培管一斜面抱子一大米胞子一一级种子一二级种子一发酵酒精酵母的扩大培
37、养：酵母原菌一固体斜面一液体试管一液体三角瓶一卡氏罐一酒母缸（二）种子制备的技术概要1、制备过程：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过 程一般都在菌种室完成。培养物选择的原那么：培养基应是有利于菌体的生长，对胞子培养基应该是有利于抱子的生长； 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产泡子和芽胞的微生物：获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸种子对于产抱子的微生物：获得一定数量和质量的胞子和菌丝体起始接种物的传代问题：菌种的传代次数尽可能的少抱子培养：母瓶一一活化、纯化，去除变异株。接种时要稀一点。子瓶一一大量繁殖，得
38、到大量泡子，从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落，接种 时密一点。生产车间段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理。培养物选择的原那么：获得一定数量的菌丝体（菌丝体比胞子要有利：缩短发酵时间，有利于获 得好的发酵结果）目的和要求：发酵培养基营养丰富。原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方 面的原因：本钱和驯化2、发酵级数确实定：一般由菌丝体培养开始计算发酵级数；注：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响（级数大，难控制、易染菌、易变异， 管理困难，一般2-4级）例：谷氨酸为三级发酵：一级种子（摇瓶）f二级种子（小罐）一发酵3、接种量确实定：接
39、种量=移入种子的体积/接种后培养液的体积方法：双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一局部种子来源于种子罐，一局部来源于发酵罐4、种龄：是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。（种龄短，菌体太少；种龄长，易老化；一般选择对数生长期末，细胞活力强）5、种子质量的要求：量：要求到达一定的浓度；质：形态理化指标：C、N、P的含量、pH、酶活等；（三）培养及环境条件1、度温：一方面在微生物最适温度范围内，生长速度随温度升高而增加，另一方面，不同生长阶段 的微生物对温度的反响不同。2、PH：各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH。3、通气和搅拌：通气量与菌种，培养基的性质以
40、及培养阶段有关。通气量的多少，最好按氧溶解的多少决定。4、泡沫：泡沫的持久存在影响微生物对氧的吸收，阻碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正 常进行，不利于发酵。消泡措施：化学消泡，机械消泡。5、染菌的控制：原因一一死角，灭菌不彻底，空气净化不好，无菌净化不好，无菌操作不严或菌种 不纯等问题。第四章发酵工程纯培养染菌的危害：1、基质的损失、产物的降解2、发酵液性质的改变，如pH、粘度3、噬菌体的感染，培养菌消失4、产物提取的困难（一）严格消毒灭菌1、控制有害微生物的方法：r杀灭 控制害菌抑制彻底杀灭一一灭菌:黑、局部杀灭一一消毒 j抑制霉腐微生物防腐 刖制宿主体内的病原菌一一化疗（一）严格消
41、毒灭菌1、控制有害微生物的方法：r杀灭 控制害菌抑制彻底杀灭一一灭菌:黑、局部杀灭一一消毒 j抑制霉腐微生物防腐 刖制宿主体内的病原菌一一化疗灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，可分 杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者那么指菌体杀死后，其细胞发生溶化、 消失的现象。消毒：一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体外表或内部一局部对人体有害的病原菌，而对被消 毒的物体基本无害的措施。防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而到达防止食品等发生霉腐的措施。 （低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度、防腐剂、高压杀菌）化疗：利用具有高度选择
42、毒力（即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以到达治疗该传染病的一种措施。（各种抗生素）2、除菌的方法：培养基的加热灭菌空气的过滤除菌紫外线或电离辐射化学药物灭菌3、rWj温杀菌：干热灭菌法火焰灼烧法烘箱内热空气灭菌法巴氏消毒法高温天菌高温天菌温热天菌（消毒）法常压下，煮沸消毒法 间歇灭菌法加压下常规加压灭菌法边续加压天菌法湿热灭菌：多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理510min后即可杀死；干热灭菌：金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150170c下维持12小时；接种环、 接种针等直接灼烧；湿热更易于传递热量，更易破坏保持蛋白质稳定
43、性的氢键等结构，从而加速其变性）间歇灭菌法（丁达尔灭菌）：用于不耐热培养基的灭菌；常规加压灭菌法：适用于微生物实验室、发酵工厂中培养基、器材的灭菌；连续加压灭菌法：适用于大规模工厂中培养基灭菌；优点：既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏缩短了发酵罐的占用周期提高了锅炉的利用率 适宜于自动化操作 影响加压蒸汽灭菌效果的因素： 灭菌物体含菌量的影响 灭菌锅内空气排除程度的影响 灭菌对象pH的影响 灭菌对象的体积 加热与散热速度高温对培养基成分的有害影响及其防止有机物：如多肽类沉淀无机物：如磷酸盐、碳酸盐等沉淀褐变：产生氨基糖、隹糖或黑色素高温的有害影响破坏营养，提高色泽毒变（?）改变培养
44、基的pH（一般为降低pH）降低培养基侬度（气温低时会增加冷凝水）（二）培养基的灭菌（湿热灭菌）1、影响培养基灭菌的因素：pH值的影响（68时，最不易死亡）培养基成分；培养基中的颗粒物质（越大，灭菌越困难）2、灭菌的实际操作：空罐灭菌（要求温度较高，灭菌时间较长）实罐灭菌（三路进气）；过滤除菌法（将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗 粒阻留，从而到达除菌目的）；其他方法：在配制培养基时，为防止发生沉淀，一般应按配方逐一加入各种 成分；,溶液状态（气体状态3、化学杀菌剂或制菌剂外表消毒剂化学因素I1r抗代谢药物：磺胺类等化学治疗剂I抗生素中草药有效成分I外表消毒剂：对一切活细胞都
45、有毒性，不能用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂（当其在极低浓 度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌 和杀菌作用；比拟活性轻度用石炭酸系数做标准）灭菌效果监测：高压蒸气灭菌效果监测一一高压蒸气灭菌指示卡、芽胞菌片法； 紫外线消毒效果监测一一微型紫外线强度计（三）空气的净化1、发酵对无菌空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标发酵对无菌空气的无菌程度要求是：发酵过程中不因无菌空气染菌而造成损失；2,、空气除菌的方法：辐射灭菌法：多用紫外线进行无菌室的灭菌（使微生物DNA形成二聚体，穿透力弱）；热灭菌：基于加热后微生物体内的蛋白（酶）热变性
46、而得以实现；（空气需先压缩，提高压力） 静电除菌：利用静电引力来吸附带电粒子而到达除尘灭菌目的；（直径小、带电荷少的无吸附） 介质过滤除菌：空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中, 而到达除菌的目的；作用机理：1.拦截效应：当某一粒径的粒子运动到纤维外表附近时，其中心线到纤维外表的 距离小于微粒半径，灰尘粒子就会被滤料纤维拦截而沉积下来。2 .惯性效应：当微粒质量较大或速度较大时，由于惯性而碰撞在纤维外表而沉积 下来。3 .扩散效应：小粒径的粒子布朗运动较强而容易碰撞到纤维外表上。4 .重力效应：微粒通过纤维层时，因重力沉降而沉积在纤维上。5 .静电效应：纤维或粒
47、子都可能带电荷，产生吸引微粒的静电效应，而将粒子吸 到纤维外表上。惯性撞击截留、拦截截留和布朗运动截留的作用较大，重力和静电引力的作用那么很小；3、空气除菌流程：空气在除菌之前为什么要经过加热流程别离油、水以后的空气的相对湿度仍然为100%,当温度稍微下降时就会析出水来，使过滤介 质受潮。因此，还必须使用加热器来提高空气温度，降低空气的相对湿度（要求在60%以下），以 免析出水来。空气在旋风别离和丝网除油之前为什么要经过冷却流程？从空气压缩机出来的空气，温度为120。C或150。C,其相对湿度大大降低，如果在此高温下 就进入空气过滤器过滤，可以减少压缩空气中夹带的水分，使过滤介质不致受潮。但是一般的过 滤介质耐受不了这样高的温度。因此，压缩空气一般先通过冷却，降低温度，提高空气的相对湿 度，使其到达饱和状态并处于露点以下，使其中的水分凝结为水滴或雾沫，从而将它们别离除去。 4、空气过滤的介质：棉花与活性炭结合；超细玻璃纤维纸（除菌效果好，但易被油水污染）；影响介质过滤因素：介质纤维直径、介质滤层厚度、介质填充密度和空气流量等；5、提高过滤除