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1、 ICS 67.160.10 X 62 团团 体体 标标 准准 T/NAIA 01102022 葡萄酒中多种非食用着色剂的测定葡萄酒中多种非食用着色剂的测定 液相色谱液相色谱-质谱质谱/质谱法质谱法 Determination of various illegal pigment in wine LC-MS/MS 2022-03-15 发布 2022-03-31 实施 宁夏化学分析测试协会宁夏化学分析测试协会 发发 布布 全国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 前前 言言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则规定编写。本
2、文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。本文件起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院（国家市场监管重点实验室（枸杞和葡萄酒质量安全）、宁夏工商职业技术学院、宁夏回族自治区食品质量监督检验二站、宁夏化学分析测试协会 本文件主要起草人：汤丽华、李谦、马雪梅、吴明、汪洪、吕毅、马桂娟、张瑶、辛世华、赵瑞、张小飞。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 葡萄酒中多种非食用着色剂的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 1 范围范围 本文件规定了葡萄酒中碱性橙 2、碱性嫩黄 O、碱性橙 21、碱性橙 22、柑橘红 2 号 5 种非食用着色剂的液相色谱质谱检测方法。本文件适用葡萄酒
3、（包括白葡萄酒、红葡萄酒）中碱性橙 2、碱性嫩黄 O、碱性橙 21、碱性橙22、柑橘红 2 号的测定和确证。2 2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 23496 食品中禁用物质的检测 碱性橙染料 高效液相色谱法 SN/T 4523 出口葡萄酒中多种非法着色剂的测定 液相色谱-质谱/质谱法 3 3 术语和定义术语和定义 4 4 方法提要方法提要 液体试样经乙腈提取后，用无水硫酸镁、乙二胺
4、-N-丙基硅烷（PSA）净化后，氮吹至干，定容后经 C18色谱柱分离，液相色谱-质谱仪测定和确证，外标法定量。5 5 试剂和材料试剂和材料 本方法所用的试剂，除另有规定外，均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。5.5.1 1 试剂试剂 5.1.15.1.1 乙腈：色谱纯。5.1.25.1.2 甲醇：色谱纯。5.1.35.1.3 甲酸：优级纯。5.1.45.1.4 0.1%甲酸水溶液：1mL 甲酸用水定容到 1000mL。5.1.55.1.5 无水硫酸镁：优级纯。5.1.65.1.6 氯化钠：分析纯。5.1.75.1.7 乙二胺-N-丙基硅烷(PSA):4060m。5.25.2 标
5、准品标准品 5.2.5.2.1 1 标准品：碱性橙 2（Basic Orange 2，CAS 号 532-82-1，C12H13CLN4）、碱性嫩黄 O（Auramine O，CAS 号，2465-27-2，C17H22CLN3）、碱性橙 21（Astrazon Orange G，CAS 号 3056-93-7，C22H23CLN2）、罗丹明 B（Rhodamine B，CAS 号 81-88-9，C28H31CLN2O3）、碱性橙 22(Astrazon 全国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 Orange R，CAS 号 4657-00-5，C28H27CLN2)、柑橘红 2
6、 号(Citrus red 2，CAS 号：6358-53-8，C28H16N2O3)，纯度均98%。5.2.5.2.2 2 标准储备液：准确称取适量的标准品，用乙腈配制成浓度为 100.0g/mL 的标准储备溶液，-18保存，有效期三个月。5.2.35.2.3 标准工作液：根据需要，用空白样品基质溶液配制适当浓度的标准工作液，临用现配。6 6 仪器和设备仪器和设备 6.16.1 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源(ESI)。6.26.2 分析天平：感量 0.1mg 和 0.01g。6.36.3 涡旋混合器。6.46.4 离心机：最大转速 10000r/min。6.56.5 氮吹仪：可温控
7、。6.6.6 6 超声波发生器。7 7 分析步骤分析步骤 7.17.1 试样制备试样制备 将所取原始样品 1kg 在瓷混样桶内充分混匀，将混匀样品置于洁净容器内密封，作为试样。7.27.2 试样的提取试样的提取 称取试样 10.0 g（精确到 0.01g）于 50 mL 聚四氟乙烯离心管中，加入 3g 无水硫酸镁、1.5g 氯化钠，再加入 10mL 乙腈，涡旋混匀 1 min，超声提取 10 min，8000 r/min 离心 5 min，吸取上清液，残渣再用 10 mL 乙腈重复提取 1 次，合并上清液，混匀，8000 r/min 离心 5 min。吸取 8 mL 上述混合提取液加入内含 9
8、00mg 无水硫酸镁、150mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）的 15mL 塑料离心管中净化，涡旋混匀 1 min，8000 r/min 离心 5 min，取 1mL 净化液，用小流速氮气吹至近干，加入 1mL初始流动相，涡旋混匀，过 0.22m 微孔滤膜，用于测定。7.7.3 3 仪器参考条件仪器参考条件 7.3.17.3.1 液相色谱参考条件液相色谱参考条件 7.3.1.1 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18，50 mm 2.1 mm，粒径 1.8 m 或性能相当者。7.3.1.2 柱温：40。7.3.1.3 流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈；梯度洗脱见表 1。7
9、.3.1.4 流速：0.30mL/min。7.3.1.5 进样量：2L。表表 1 1 流动相及梯度洗脱条件 时间/min 流速/（mL/min）流动相 A/%流动相 B/%0.00 0.30 90 10 0.50 0.30 90 10 2.50 0.30 45 55 8.50 0.30 10 90 全国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 10.00 0.30 0 100 11.00 0.30 90 10 15.00 0.30 90 10 7.3.27.3.2 质谱参考条件质谱参考条件 7.3.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI）。7.3.2.2 扫描方式：正离子扫描。7.3.2
10、.3 检测方式：多反应监测（MRM）。7.3.2.4 离子源温度：325。7.3.2.5 气体流速：6L/min。7.3.2.6 雾化器压力：45psi。7.3.2.7 鞘气温度：350。7.3.2.8 鞘气流速：11L/min。7.3.2.9 毛细管电压：3500V。7.3.2.10 喷嘴电压：500V。7.3.2.11 定性离子对、定量离子对、碰撞能量等参数参见附录 A。7.47.4 定量测定定量测定 根据样液中被测物含量情况，选定浓度相近的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作溶液和待测样液中 5 种非食用着色剂的响应值均应在仪器检测的线性范围内。基质混合标准工作溶液与样液等体积进样测定
11、。标准溶液及样液均按 7.3.1 和 7.3.2 规定的条件进行测定，如果样液中与标准溶液相同的保留时间有峰出现，则对其进行确证，碱性橙 2、碱性嫩黄 O、碱性橙 21、碱性橙 22、柑橘红 2 号的参考保留时间见表 2。碱性橙 2、碱性嫩黄 O、碱性橙 21、碱性橙 22、柑橘红 2 号标准品的多反应监测（MRM）色谱图参见附录 B，采用基质溶液标准曲线外标法定量。表表 2 2 参考保留时间 被测物名称 保留时间/（min）碱性橙 2 2.361 碱性嫩黄 O 2.818 碱性橙 21 3.018 碱性橙 22 3.548 柑橘红 2 号 6.146 7.57.5 定性测定定性测定 经确证分
12、析被测物质量色谱峰保留时间与标准物质相一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，所选择的离子均出现。同时所选择离子的丰度比与标准样物质相关离子的相对丰度一致，相似度在允许偏差之内（见表 3），则可判定样品中存在对应的被测物。表表 3 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50 20至 50 10至 20 10 允许的相对偏差 20 25 30 50 全国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 7.67.6 空白试验空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行。8 8 分析结果的表述分析结果的表述 试样中 5 种非食用着色剂含量按式（1）进行计算：式中：X 样本中各种非食用着色
13、剂含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C 测定溶液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；C0 空白基质溶液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V 样本溶液提取溶液体积，单位为毫升（mL）；m 试样质量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值，测定结果用平行测定的算数平均值表示，保留两位有效数字。9 9 精密度精密度 在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。1010 定量限定量限 本方法的碱性橙 2、柑橘红 2 号定量限为 0.002mg/kg，碱性嫩黄 O、碱性橙 21、碱性橙 22 定量限为 0.001mg/kg。）（1100010000mvccX全
14、国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 附录附录 A A(资料性附录资料性附录)表表 A.1 5 种非食用着色剂的质谱参数种非食用着色剂的质谱参数 被测物名称 母离子(m/z)子离子(m/z)碎裂电压（V）碰撞能量（eV）77.0*120 30 碱性橙 2 213.0 120.8 120 15 147.1*133 34 碱性嫩黄 O 268.2 252.1 133 30 300.2*145 22 碱性橙 21 315.3 270.2 145 40 376.3*160 25 碱性橙 22 391.3 361.3 160 42 153.0*135 40 柑橘红 2 号 309.1 27
15、8.0 135 12 全国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 附录附录 B(资料性附录资料性附录)5 种非食用着色剂的多反应监测（种非食用着色剂的多反应监测（MRM）总离子流图见图）总离子流图见图 B.1。图图 B.1 5 种非食用着色剂的多反应监测（种非食用着色剂的多反应监测（MRM）总离子流图）总离子流图 5 种非食用着色剂的多反应监测（种非食用着色剂的多反应监测（MRM）色谱图见图）色谱图见图 B.2。全国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 全国团体标准信息平台 T/NAIA 01102022 图图 B.2 5 种非食用着色剂的多反应监测（种非食用着色剂的多反应监测（MRM）色谱图）色谱图 全国团体标准信息平台