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1、ICS 65.150CCS B 50SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 54802022虹鳍成分鉴定技术规范实时荧光PCR法Technical specification for rainbow trout species identification-real-time PCR method2022-07-07 发布2023-02-01 实施中华人民共和国海关总署 发布SN/T 54802 02 2.t/.刖 百本文件按照GB/T 1.12 02 0标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：上海海
2、关动植物与食品检验检疫技术中心、上海科技大学、厦门海关技术中心。本文件主要起草人：蔡一村、王瑛、林颖峥、蒋静、徐淑菲、张强、王鑫杰、薛俊欣、王艳、潘良文、赵简。ISN/T 54802 02 2虹酶成分鉴定技术规范实时荧光PCR法1范围本文件规定了虹蹲物种成分实时荧光PCR检测方法。本文件适用于水生动物及其产品中虹直尊物种成分定性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。SN/T 5203鱼类物种鉴定基因条形码的检测技术规范3 术语
3、和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1虹鲜 Oncorhynchiis mykiss又叫虹畦、麦奇钩吻处.属于鞋科、太平洋处房.3.2吉尔大麻哈鱼 Oncorhynchiis gilae属于鲤科、太平洋处属。3.3线粒体 DNA mitochondrial DNA-mtDNA线粒体中的遗传物质.线粒体能为细胞产生能量是在细胞线粒体内发现的脱氧核糖核酸特殊形 与一般位于细胞核内的D、A有不同的演化起源.可能是源自早期细菌。3.4实时荧光 PCR Real-time PCR实时荧光定量PCR.是指在PCR反应体系中加入荧光基团.利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程。Ct 值 cycle th
4、reshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。O.mykiss：虹8尊(oncorhynchiis mykiss),DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)dTP：脱氧核甘酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)o1S7T 54802 02 2bp：碱基对（basepair）。real-time PCR：头时荧光定量 PCR（real-time polymerase chainreaction）o5试剂与仪器5.1 DA提取试剂或DA提取试剂盒（参见附录A）。5.2 real-ti
5、me PCR反应配套试剂.5.3 蛋白酶K溶液.分析纯。5.4 70%乙醇,分析纯。5.5 TE 缓冲液（Tris-C1、EDTA 缓冲液）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,1 mmol/L EDTA（pH8.0）o5.6引物：用去离子水将每条引物探针配制成100/“nol/I,储存液.置-2 0（以下冻存；使用时取适量 配制成10 f，mol/L工作液.避免多次冻融序列见表1。特异性序列参见附录B。表1引物探针序列名称引物探针序列（5，一3，）O.mykiss-FAGTAATTATCGGCATACGAAACCAGO.mykiss-RGTTTCGATAATGATCAGTAC
6、TGGGATCO.mykiss-PFAM-CTACGGCCGCCCTCGGCCATTTAT-TAMRA6器材与设备高速台式冷冻离心机、实时荧光PCR仪及相关配套设备、anoDrop微量核酸蛋白测定仪、分析天 平、匀浆机、恒温振荡水浴设备、涡旋振荡仪、核酸分析仪、超净工作台、不同量程移液器、离心管等。7取样7.1取样对象主要水生动物及其制品。7.2取样部位宜取鲜活的组织，成鱼宜取但不限于肌肉组织（心、脑、睥、肾、肝、肠、胃等器官也适用）.鱼卵取卵 膜=如需非致死性取样.剪取部分鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块3 mn?5 mm3的肌肉块即 可。其他水生动物及其制品.例如罐头等宜取肌肉组织部分.
7、少有脂肪组织。7.3样品预处理样本经过研磨后.称取200 mg固体样本或吸取200,UL液态样本于2 ml离心管中。每个样本取 3份.分别标记为检测样品、复检样品和保存样品.加封标记后冷冻保存备用。2SN/T 54802 02 28检测步骤8.1 DNA提取取20 mg剪碎样品组织或组织匀浆液置于1.5 ml.离心管中.加入600 裂解液（见附录A）和 204,蛋白酱K溶液（见附录A）,混匀置56 水浴1 h3 h.其间每15 min轻微振动混匀；待消化完 全.冷却至室温.加入200 醋酸镂溶液（见附录A）.混匀.41冷却5 min10 min.使蛋白质析出；于 4 ,1 2 000 g离心1
8、0 min.上清液转移至另一1.5 ml.离心管中于4.12 000 g离心10 min.取上 清液至另一个洁净1.5 ml,离心管中.加等体积异丙醇.轻轻摇匀，4 放置15 min；4 X：,12 000 g离心 10 min沉淀DMA;弃上清.力口 1 ml.75%乙醇轻轻混匀.于4 ,12 000 r/min离心5 min.弃上清晾 干；干燥后加入50位,去离子水溶解：DA提取液应置冰上备用.若需长期保存应置于*2 0 保存。也可采用经验证可靠的商业化DNA提取纯化方法或试剂盒进行核酸提取.具体参照说明书使用。8.2 D、A浓度和纯度的测定吸取D、A提取液1包,，以去离子水作为空白对照.
9、使用NanoDrop微量核酸蛋白测定仪测定 DNA模板的质量浓度及A 2 60 M 2 80比值。DNA的质量浓度根据以下公式计算：DA的质量浓度一 4260*50*稀释倍数（理/1）。当A./A.比值在1.71.9之间时.适合于后续PCR扩增，8.3 对照和平行设置检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照、空白对照。用含目标成分的样品或含目标片段的质粒作为阳性对照.以不含目标成分的样品或不含目标片段 的质粒作为阴性对照以双蒸水为空白对照，样品和对照设置2个平行的反应体系。8.4 反应体系在0.2 ml.PCR反应管中.按表2配制反应体系.加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对 照的次序分别
10、加入模板.盖上管盖充分混匀。表2 real-time PCR实验反应体系试剂a工作液浓度体积Master Mix2 X12.5 心O.mykiss-F10/xM1O.mykiss-R101 mLO.mykiss-P10/xM0.5/xLDNA模板5 ptL水5 ptL:ft终反应体系中试剂添加的种类和总体系体积可能会根据不同的real-time PCR平台产生差异。进行不同real-time PCR平台的体系配置时，需妾参照不同平台real-time PCR仪说明书，并且需要保证表1中所列组分的 终浓度不变。8.5反应程序95 10 min；95 15 s,60 1 min,40 个循环。注：
11、根据不同real-time PCR仪器和配套试剂的要求，可以对反应程序中循环（扩增）步骤进行相应等效修改。3S7T 54802 02 29质量控制以下条件有任一不满足时实验视为无效：9.1空白对照：荧光通道无荧光信号检出，Ct值40.0；9.2阴性对照：荧光通道无荧光信号检出，Ct值40.0；9.3阳性对照：荧光通道有荧光信号检出且出现典型的扩增曲线，Ct值=35.0。10结果判定10.1在符合第9章的情况下.检测结果按以下进行判定：10.1.1如Ct值=3 5.0,则判定为检出虹鳄或吉尔大麻哈鱼成分;10.1.2如Ct值340.0,则判定为未检出虹鳄成分;10.1.3如3 5.0VCt值V4
12、0.0,则重复一次。如再次扩增后Ct值仍40.0,则判定为检出虹号或吉尔 大麻哈鱼成分；如再次扩增后Ct值40.0.则判定为未检出虹鳞成分。10.2如需要确定物种为虹直尊.可采用SN/T 5203进行确认。4SN/T 54802 02 2附录 A（规范性）试剂配制.1裂解液1 mol/L Tris-IICKpII 8.0)0.5 mol/L EDTA0.5 mol/L NaCl10%SDS加去离子水定容至100 ml.。1 mL1 mL2 0 mL10 mLA.2 蛋白酶K溶液（2 0 mg/mL）将2 00 mg蛋白酶K加入9.5 ml.水中.轻轻摇动.直至蛋白衡K完全溶解。不应涡旋混合。加
13、去 离子水定容到10 ml.,然后分装成小份.置于一2 0 保存。A.3 醋酸镀溶液（7.5 mol/L）称取578.12 g醋酸镂.加去离子水定容到1 I一5SN/T 54802 02 2附录 B(资料性)特异性基因序列线粒体基因片段 MitochondrialDNAfragment(GenBank：LC05073 5.1)AGTAATTATCGGCATACGAAACCAGCCTACGGCCGCCCTCGGCCATTTATTGCCTGAAGGAACCCCCGTTCCACTGATCCCAGTACTGATCATTATCGAAAC注：下划线部分分别为上下游引物和探针序列，扩增产物片段102 bpe6SN/T 5480-2022中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 虹鳞成分鉴定技术规范实时荧光PCR法 SN/T 54802 02 2*中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部：(010)65194242-7530网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880X12 3 0 1/16 印张0.75 字数18千字 2023年1月第一版2023年1月第一次印刷 印数1500*书号：135175899 定价12.00元