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1、实用HPLC方法的建立 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望目录n n1 1 前言前言n n2 2 HPLCHPLC方法建立的步骤方法建立的步骤n n2.1 2.1 了解样品的有关情况了解样品的有关情况n n2.2 2.2 明确分析目的明确分析目的n n2.3 2.3 样品的预处理与检测样品的预处理与检测n n2.4 2.4 HPLCHPLC分析模式的选择分析模式的选择n n2.5 2.5 色谱条件色谱条件n n2.6 2.6 方法的优化，及色谱现象的解
2、析和处理方法的优化，及色谱现象的解析和处理n n2.7 2.7 定性和定量方法的建立及论证定性和定量方法的建立及论证n n3 3 色谱条件的选择色谱条件的选择n n3.1 3.1 流动相的选择流动相的选择n n3.2 3.2 检测器的选择检测器的选择n n3.3 3.3 样品的溶解及预处理样品的溶解及预处理n n3.4 3.4 样品的进样量样品的进样量n n3.53.5色谱柱的选择及保护与再生色谱柱的选择及保护与再生n n3.6 3.6 泵的选择泵的选择n n3.7 3.7 色谱工作站色谱工作站n n4 4 分析方法建立的实例分析方法建立的实例n n4.1 4.1 等度分析等度分析n n4.2
3、 4.2 梯度方法的建立梯度方法的建立n n4.3 4.3 色谱柱及色谱柱及pHpH的影响的影响5 5 色谱分析中各种图谱现象的判断色谱分析中各种图谱现象的判断5.1 5.1 基线噪音的产生和处理基线噪音的产生和处理5.2 5.2 基线漂移基线漂移(上漂和下漂上漂和下漂)5.3 5.3 倒峰的产生和消除倒峰的产生和消除5.4 5.4 鬼峰的产生和消除鬼峰的产生和消除5.5 5.5 峰前移和退后的判断峰前移和退后的判断5.6 5.6 前沿峰和拖尾峰的判断前沿峰和拖尾峰的判断5.75.7色谱双峰的判断色谱双峰的判断5.8 5.8 色谱峰变胖的判断和处理色谱峰变胖的判断和处理1 前言n nHPLCH
4、PLC作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。析手段。n nHPLCHPLC技术的发展和科技的进步，使得技术的发展和科技的进步，使得HPLCHPLC广泛应用广泛应用到各个领域。到各个领域。n nHPLCHPLC实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要。各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要。n nHPLCHPLC技能是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄技能是
5、一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。发，非一日之功。出的来，跑的快，分的开2 HPLC方法建立的步骤2.1 了解样品的有关情况n n首首先先应应对对样样品品有有足足够够的的了了解解，并并明明确确分分析析目目的的（同同一一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。n n样品的重要性质包括：样品的重要性质包括：o o所含化合物的数目；所含化合物的数目；o o化学结构（官能团）；化学结构（官能团）；o o分子量；分子量；o opKapKa值；值；o oUVUV光谱图；光谱图；o o被测组分在样品中的浓度范围；被测组分在样品中的浓度范围；o
6、 o样品的溶解度、沸点及其稳定性；样品的溶解度、沸点及其稳定性；o o可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。n n1 1 分析大分子、小分子还是生物分子分析大分子、小分子还是生物分子n n一般常规的一般常规的HPLCHPLC分析分子量分析分子量20002000以下，大分子一般以下，大分子一般采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体系。系。n n2 2 样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。n n如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混如果是天然物质，一般分离完
7、全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物。采用梯度，是否是系列反应的产物。n n3 3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。n n主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。何种提取方法和检测的灵敏度等。n n4 4 分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化
8、合物、两性化合物。合物、两性化合物。n n非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采用反相体系。的溶剂，可采用反相体系。n n弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改性剂，调节合适的相中添加改性剂，调节合适的pHpH。n n离子化合物可以采用反相，调节离子化合物可以采用反相，调节pHpH；或者添加离子或者添加离子对试剂；也可采用离子交换。对试剂；也可采用离子交换。n n两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的则考虑离子交换；也
9、可考虑衍生后测定。峰快的则考虑离子交换；也可考虑衍生后测定。n n对于极性的糖类物质，可用对于极性的糖类物质，可用NH2NH2柱，有条件的用聚柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。n n大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物柱子。的色谱柱，多为聚合物柱子。n n手性化合物，则要用手性流动性或者采用手性柱。手性化合物，则要用手性流动性或者采用手性柱。n n5 5 样品的溶解度、沸点样品的溶解度、沸点n n样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常样品在不同溶剂中的溶解度
10、，对色谱条件的选择非常重要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能重要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类型的类型。n n非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以于非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。反相为上策。n n极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同pHpH下区别下区别可能很大。可能很大。n n极性化合物在水和极性溶剂中都有一定的溶解度。极性化合物在水和极性溶剂中都有一定的溶解度。n n从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。
11、从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。n n易挥发性的低沸点的物质在易挥发性的低沸点的物质在ELSDELSD中难以检测。中难以检测。n n有存在特例。有存在特例。n n6 6 样品的稳定性样品的稳定性n n如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。时需注意。n n对光敏感物质，用棕色瓶，避光保存，不宜存放，随对光敏感物质，用棕色瓶，避光保存，不宜存放，随配随做。配随做。n n易水解的物质、要选择合适的溶解溶剂。易水解的物质、要选择合适的溶解溶剂。n n有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，
12、而要用乙腈。乙腈。n n易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节pHpH，如如PAPPAP的测定。胺类化合物。的测定。胺类化合物。n n产品不稳定的化合物，分析越快越好。产品不稳定的化合物，分析越快越好。n n7 7 化合物的化学结构（官能团）化合物的化学结构（官能团）n n常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有COOHCOOH、OHOH、NH2NH2、SO3HSO3H、ClCl（BrBr）、）、CHOCHO、COCO、CH3CH3、C2H5C2H5、N=NHN=NH、SOSO、SO2SO2、-O-O-等
13、。等。n n亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。出峰后移。n n从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。n n8 8 化合物的化合物的pK pK 值值n n知道知道pKpK值，有助于方法的建立，尤其流动相值，有助于方法的建立，尤其流动相pHpH的选择。的选择。n npKpK的差异是官能团造成的。的差异是官能团造成的。n n9 UV9 UV光谱图光谱图n n知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有DADDAD则关系不大。多组分的样品，宜多选几个波长。则
14、关系不大。多组分的样品，宜多选几个波长。n n同一样品在不同的流动相及同一样品在不同的流动相及pHpH最大波长可能不一最大波长可能不一致。致。n n有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低紫外区有一定的吸收紫外区有一定的吸收n n10 10 样品的复杂层度样品的复杂层度n n梯度方法分析梯度方法分析n n预处理预处理,分成几个部分分析分成几个部分分析n n痕量物质的富集痕量物质的富集n n总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分
15、析难度。度。2.2 明确分析目的n n1 1 定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定？光谱鉴定？n n2 2 是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组分析？分析？n n3 3 定量分析的准确度和精密度？（主成分在定量分析的准确度和精密度？（主成分在1 12 2）n n4 4 不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等）残留、环境样品等）n n5 5 分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的分析的工作量，少
16、数还是大量？时间和效率与分离的选择。选择。n n6 6 实验室的条件，如实验室的条件，如HPLCHPLC仪器的配置和档次；色谱柱仪器的配置和档次；色谱柱系统；是否有恒温；是否可以做梯度；分析成本；实验系统；是否有恒温；是否可以做梯度；分析成本；实验室人员的操作技能；方法的移植等等。室人员的操作技能；方法的移植等等。2.3 样品的预处理与检测n n样品来源的形式样品来源的形式n n1 1 可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）n n2 2 需稀释、需稀释、pHpH缓冲、加内标或其它操作缓冲、加内标或其它操作n n3 3 固体样品选择合适的溶剂固体样品选择
17、合适的溶剂n n4 4 需提取分离的样品需提取分离的样品n n5 5 预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。物质。n n总之，将样品溶于合适的溶液；或者用合适的溶液总之，将样品溶于合适的溶液；或者用合适的溶液提取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在提取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意被测组分的稳定性和提取率。处理中应注意被测组分的稳定性和提取率。2.4 HPLC分析模式n n按照样品的特性分为以下二类：按照样品的特性分为以下二类：n nA A 一般样品（一般样品（2000 -强有机溶剂强有机溶剂)通常最有效。通常最有效
18、。n n低低 pH pH 流动相流动相,如如 0.1%0.1%TFA or 0.01M H3PO4,TFA or 0.01M H3PO4,也是有也是有效的。效的。n n升高温度（升高温度（60-8060-80）n n色谱柱的修复和再生色谱柱的修复和再生-化学变化化学变化 IIIIn nExample:Example:4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 Flow rate:1 mL/min;Temp:80 Flow rate:1 mL/min;Temp:80 A:0.1%TFA in wate
19、r A:0.1%TFA in water B:0.1%TFA in acetonitrile B:0.1%TFA in acetonitrile 100%A for 30 min.;0-100%B over 30 min.;100%A for 30 min.;0-100%B over 30 min.;Hold 100%B for 30 min.,Return to 100%A in 5 Hold 100%B for 30 min.,Return to 100%A in 5 min.min.Repeat 3 timesRepeat 3 times。n n6 6M M盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素等溶液
20、可用于清除蛋白盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白质的沉积。质的沉积。n nXDB,XDB,有机聚合物等填料可使用高有机聚合物等填料可使用高pH pH 水溶液水溶液/有机溶有机溶液，如：液，如：n n0.010.01M NaOH 50%M NaOH 50%异丙醇异丙醇/水溶液，硅胶基质应尽量减水溶液，硅胶基质应尽量减少接触时间少接触时间(15-30 (15-30 min)min)。n n3.56 3.56 色谱柱使用的几个注意点使用保护柱色谱柱使用的几个注意点使用保护柱n n样品和流动相过滤样品和流动相过滤n n柱子反做柱子反做(当正做实在不行时当正做实在不行时)n n当柱压明显升高时
21、，对柱头塞板清洗及更换部分填料。当柱压明显升高时，对柱头塞板清洗及更换部分填料。n n少使用离子对试剂少使用离子对试剂n n色谱柱避免强酸强碱接触，选择合适保存条件。色谱柱避免强酸强碱接触，选择合适保存条件。n n分析时，避免长时间色谱柱进大量气泡，长时间不用，分析时，避免长时间色谱柱进大量气泡，长时间不用，经常保存流动相过，防止柱子干掉。经常保存流动相过，防止柱子干掉。3.6 泵的选择n n泵可分为单泵、双泵和四元泵。方法建立建议用双泵泵可分为单泵、双泵和四元泵。方法建立建议用双泵或四元泵。或四元泵。n n泵也可分为高压混合和低压混合。四元泵是低压混合。泵也可分为高压混合和低压混合。四元泵是
22、低压混合。n n高压混合不易出气泡，低压混合应严格脱气，最好用高压混合不易出气泡，低压混合应严格脱气，最好用在线脱气机。在线脱气机。n n为避免气泡产生，可在柱后接反压柱。为避免气泡产生，可在柱后接反压柱。n n分析完后，避免盐类在管路中过夜。分析完后，避免盐类在管路中过夜。n n泵的运行压力建议不超过极限值的泵的运行压力建议不超过极限值的50506060。3.7 色谱工作站n n如有可能，建议采用原装色谱工作站。有的单位因经如有可能，建议采用原装色谱工作站。有的单位因经费紧张，采用国产工作站，这也可以的。费紧张，采用国产工作站，这也可以的。n n国内工作站种类很多，但技术支持都比较弱。国内工
23、作站种类很多，但技术支持都比较弱。n n研究、方法开发的单位还是采用原装工作站比较好，研究、方法开发的单位还是采用原装工作站比较好，并注意及时升级。并注意及时升级。4 分析方法建立的实例4.1 4.1 4.1 4.1 等度分析等度分析等度分析等度分析色谱柱：色谱柱：C18C18，4mm30mm4mm30mm流动相：乙腈流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，水，不同的溶剂强度，60/4060/40、50/5050/50、40/6040/60，由强渐弱，由强渐弱流速：流速：2 2ml/minml/min.样品：样品：对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)Methyl Para
24、ben)对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)Propyl Paraben)对羟基苯甲酸丁酯对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)Butyl Paraben)改变容量因子 K改变选择性an n通过改变流动相改变选择性通过改变流动相改变选择性uu同样强度的不同溶剂同样强度的不同溶剂n n改变色谱柱改变色谱柱4.2 梯度方法的建立n n梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点n n优点优点单位时间的分离能力增加单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高检测灵敏度提高n n缺点缺点仪器设备要求高仪器设备要求高不适合某些检测方式不适合某些检测方式柱需再生柱需再生定量分析的重复性较低定量
25、分析的重复性较低分析时间长分析时间长梯度的洗脱方式n n高压梯度及低压梯度高压梯度及低压梯度梯度洗脱的可变参数n nA A及及B(B(可能还有可能还有C C和和D D液液)的成分和化学特性的成分和化学特性n n梯度的陡度梯度的陡度n n梯度的变化形状梯度的变化形状如不用梯度：分离不理想梯度条件的优化梯度曲线的变化凹线梯度曲线的变化凸线梯度平衡时间的影响（一）10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复梯度平衡时间的影响（二）平衡时间6分钟平衡时间7分钟平衡时间8分钟平衡时间9分钟平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个
26、时间时，平衡充足。有机污染物的影响（一）50ml超纯水的有机物污染状态有机污染物的影响（二）“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析有机污染物的影响（三）典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析梯度方法开发实例-第一步n开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好梯度方法开发实例-第二步为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。梯度方法开发实例-第三步 从空白梯度图显示，
27、在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。梯度方法开发实例-第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。梯度方法开发实例-第五步 根根据据“梯梯度度曲曲线线下下的的面面积积越越大大，洗洗脱脱能能力力越越强强”的的规规律律，试试用用#5#5曲线使曲线使3-93-9号峰提前号峰提前(曲线曲线5 5，50-100%50-100%B)B)，但是小峰仍没有分出来。但是小峰仍没有分出来。梯度方法开发实例-第六步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律
28、，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。梯度方法开发实例-第七步最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。4.3 色谱柱及pH的影响尿嘧啶尿嘧啶3-3-丁基丁基吡啶吡啶4-4-苯基苯基丁胺丁胺4 4-苯基丁酸苯基丁酸苯酚苯酚丙丙基苯基苯1,4-1,4-二羟基蒽醌二羟基蒽醌N,N-N,N-二二乙基间甲苯酰胺乙基间甲苯酰胺丁基丁基苯苯*4-Phenylbutylamine was not used for testing at pH 2.5*4-Phenylbutyric acid was not used for testing at pH 7苯苯基基aa芘芘1,2:3
29、,4:5,6:7,81,2:3,4:5,6:7,8-四四苯基萘苯基萘菲菲3,4-c3,4-c并并菲菲n nHPLC HPLC HPLC HPLC 条件条件条件条件-试验试验试验试验 1 1 1 1n n流动相：流动相：流动相：流动相：乙腈：乙腈：乙腈：乙腈：20mM 20mM 磷酸钾磷酸钾缓冲液缓冲液 pH 2.5(65:35)pH 2.5(65:35)n n流速流速流速流速:1.0mL/min1.0mL/minn n柱温柱温柱温柱温:3030C Cn n紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器:254nm254nmn n进样量进样量进样量进样量:1010 L Ln n样品样品样品样品(mg/
30、mL):(mg/mL):(mg/mL):(mg/mL):尿尿嘧啶嘧啶(0.025),3-(0.025),3-丁基丁基吡啶吡啶 (0.067),(0.067),苯酚苯酚(0.90),4-(0.90),4-苯基苯基丁酸丁酸(2.1),N,N-(2.1),N,N-二二乙乙基间甲苯酰胺基间甲苯酰胺(0.66),(0.66),1,41,4二羟基蒽醌二羟基蒽醌(0.20),(0.20),丙基丙基苯苯(5.0),(5.0),丁基丁基苯苯(6.7)(6.7)用用流动相溶解流动相溶解n nHPLC HPLC 条件条件条件条件-试验试验试验试验 2 2n n流动相流动相流动相流动相:乙腈乙腈乙腈乙腈:20mM:2
31、0mM 磷酸磷酸盐缓冲液盐缓冲液,pH 7.0(65:35)pH 7.0(65:35)n n流速流速流速流速:1.0mL/min1.0mL/minn n柱温柱温柱温柱温:3030 C Cn n紫外紫外紫外紫外检测器检测器检测器检测器:254nm 254nmn n进样进样进样进样体积体积体积体积:1010 L Ln n样品样品样品样品(mg/mL):(mg/mL):尿尿嘧啶嘧啶(0.05),3-(0.05),3-丁基丁基吡啶吡啶(0.02),(0.02),苯酚苯酚(1.0),4-(1.0),4-苯基苯基丁胺丁胺(4.0),N,N-(4.0),N,N-二二乙基间甲苯酰胺乙基间甲苯酰胺(1.0),(
32、1.0),1,4-1,4-二羟基蒽醌二羟基蒽醌(0.20),(0.20),丙基丙基苯苯(4.0),(4.0),丁丁基苯基苯(4.0)(4.0)用用流动流动相溶解相溶解n n流动相流动相流动相流动相:乙腈乙腈:H2O:H2O(85:15)(85:15)n n流动相流动相流动相流动相:2.0mL/min2.0mL/minn n柱温柱温柱温柱温:2525C Cn n紫外紫外紫外紫外检测器检测器检测器检测器:254nm254nmn n进样进样进样进样体积体积体积体积:1010 L Ln n样品样品样品样品:苯苯苯苯aa芘芘,1,2:3,4:5,6:7,8-1,2:3,4:5,6:7,8-四四苯基萘苯基
33、萘,菲菲3,4-c3,4-c并并菲菲,丙酮丙酮HPLC 条件条件 试验试验3Column:Alltima C18,5m,150 x 4.6mm1a碱碱灭活灭活1b非非碱灭活碱灭活1.尿嘧啶2.3-丁基吡啶3.苯酚4.4-苯基丁酸5.N,N-二乙基间甲苯酰胺(DEET)6.1,4二羟基蒽醌7.丙基苯8.丁基苯Column:Adsorbosphere C18,5m,150 x 4.6mm pH 2.5 的色谱图2a碱碱灭活灭活2b非非碱灭活碱灭活pH 7 的色谱图Column:Alltima C18,5m,150 x 4.6mmColumn:Adsorbosphere C18,5m,150 x 4
34、.6mm1.尿嘧啶2.苯酚3.4-苯基丁胺4.N,N-二乙基间甲苯酰胺5.3-丁基吡啶6.1,4二羟基蒽醌7.丙基苯8.丁基苯pH2.5pH7.01.1.丙酮2.2.苯a芘 3.3.菲3,4-c并菲 4.4.1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘3 3a aPlatinumPlatinum C18,5 C18,5m,m,150 x 4.6mm150 x 4.6mm3 3b bNucleosilNucleosil C18 AB,C18 AB,5 5m,150 x 4.6mmm,150 x 4.6mm3 3c cInertsilInertsil ODS-2,ODS-2,5m,150 x 4.5m
35、m5m,150 x 4.5mm5 5 色谱分析中各种图谱现象的判断色谱分析中各种图谱现象的判断5.5.1 基线噪音的产生和处理基线噪音的产生和处理可能产生的原因及处理办法1 流动池脏，用极性试剂清洗。当有填料进入，拆开流通池。2 检测器灯有问题，如能量偏低，更换氘灯。3 周期性的波动，则起源于泵的脉冲，检修泵或更换垫片等。4 温度对检测器的影响，控制温度。5 气泡经过检测器，用大流量冲洗。6 可能难出峰的样品连续不断出来，用强极性流动相冲柱。7 流动相本底高，如水的纯度不够，换超纯水。或试剂纯度不够，换色谱纯的试剂。8 注意数据采样和连接问题。Time(min.)5.2 基线漂移（上漂和下漂）
36、1 柱中的流动相没有平衡，延长平衡时间，尤其在流动相中添加了有紫外吸收的添加剂。2 在梯度洗脱中，基线上漂是正常的，在空白梯度中有可能是柱子中有杂质洗出。其次是流动相中有干扰物。换流动相。3 温度不稳定（示差检测器），控温。4 在等度分析中，样品缓慢洗出，改变淋洗液强度或用梯度分析。5 样品进入检测器，吸附在池中，可能每进样一次，本底一次比一次高，很少见。5.3 倒峰的产生和消除 1 1 柱切换的脉冲效应，一般不是很明显，必要时考柱切换的脉冲效应，一般不是很明显，必要时考虑换阀。虑换阀。2 2 在低波长分析时，流动相本底比较高时，而样品在低波长分析时，流动相本底比较高时，而样品用本底低的流动相
37、溶解，肯定出现倒峰，其程度同用本底低的流动相溶解，肯定出现倒峰，其程度同进样量和本底差有关。解决办法，用流动相溶解样进样量和本底差有关。解决办法，用流动相溶解样品，减少进样量，消除倒峰的影响。高波长时品，减少进样量，消除倒峰的影响。高波长时,影响影响比较小。比较小。3 3 如果倒峰不影响峰的分离，对外标法定量不影响。如果倒峰不影响峰的分离，对外标法定量不影响。但影响面积归一化法。但影响面积归一化法。4 4 样品中有比流动相本底低的物质存在，如无机盐等，样品中有比流动相本底低的物质存在，如无机盐等，将出倒峰。这种情况下，倒峰的位置不一定在死体将出倒峰。这种情况下，倒峰的位置不一定在死体积位置出现
38、（大多数在死体积位置出现）。积位置出现（大多数在死体积位置出现）。5.4 鬼峰的产生和消除 1 1 样品分析时峰没出完，在下一针或下下一针出现，判断样品分析时峰没出完，在下一针或下下一针出现，判断办法，延长分析时间，计算可能出现的保留时间。然后调办法，延长分析时间，计算可能出现的保留时间。然后调整流动相。整流动相。2 2 连续进样，在某个位置出现忽高忽低的峰，最可能是进连续进样，在某个位置出现忽高忽低的峰，最可能是进样针污染，清洗进样针，注意黑垢的干扰，有些样品易残样针污染，清洗进样针，注意黑垢的干扰，有些样品易残留在针管里。可重新取样分析。留在针管里。可重新取样分析。3 3 定量管污染，处理
39、方法同上。定量管污染，处理方法同上。4 4 在死体积位置出现的小峰，可能是柱切换造成的。在死体积位置出现的小峰，可能是柱切换造成的。5 5 流动相与样品溶剂不一致，也会出现鬼峰，尤其在低波流动相与样品溶剂不一致，也会出现鬼峰，尤其在低波长时，出现位置在死体积的地方。长时，出现位置在死体积的地方。6 6 气泡，如果有小气泡通过流通池，也出现随机的假峰，气泡，如果有小气泡通过流通池，也出现随机的假峰，大气泡存在，其出现的峰往往直上直下，脱气解决。大气泡存在，其出现的峰往往直上直下，脱气解决。7 7 样品发生变化反应，重新取样快速分析。样品发生变化反应，重新取样快速分析。5.5 峰前移或退后的判断1
40、 有规律的变化一般可能是流动相没平衡，如低浓度的有规律的变化一般可能是流动相没平衡，如低浓度的缓冲液或离子对试剂，样品对缓冲液或离子对试剂，样品对pHpH变化极敏感。变化极敏感。2 2 温度变化，当天气变化快，分析时间长，比较明显，温度变化，当天气变化快，分析时间长，比较明显，用柱温箱，空调解决此类问题。用柱温箱，空调解决此类问题。3 3 流动相挥发，尤其用挥发性的酸时，时间长了酸度会流动相挥发，尤其用挥发性的酸时，时间长了酸度会发生变化，流动相新鲜配置。发生变化，流动相新鲜配置。4 4 仪器尤其泵的运行时间长后，重现性不好，仪器老化，仪器尤其泵的运行时间长后，重现性不好，仪器老化，在梯度分析
41、时尤其明显，也可能流速不稳，或有气泡。在梯度分析时尤其明显，也可能流速不稳，或有气泡。5 5 在分析某样品后，柱子可能发生改性，再次分析重现在分析某样品后，柱子可能发生改性，再次分析重现性变差，清洗或再生柱子。性变差，清洗或再生柱子。6 6 进样浓度不一，溶剂不一，也会造成保留时间不一致。进样浓度不一，溶剂不一，也会造成保留时间不一致。5.6 前沿峰和拖尾峰的判断和处理n n5.6.1 5.6.1 前沿峰的产生和处理（对称性小于前沿峰的产生和处理（对称性小于0.9)0.9)n n1 1 色谱柱漏穿，柱效明显偏低，柱压偏低，如所有峰都色谱柱漏穿，柱效明显偏低，柱压偏低，如所有峰都出现，换柱。出现
42、，换柱。n n2 2 样品溶剂极性远大于流动相，局部改变了流动相平衡样品溶剂极性远大于流动相，局部改变了流动相平衡体系，办法是减少进样量，更换样品溶剂。体系，办法是减少进样量，更换样品溶剂。n n3 3 分离不完全，有大量峰重叠，（如系列物），办法，分离不完全，有大量峰重叠，（如系列物），办法，改变流动相，采用梯度洗脱。改变流动相，采用梯度洗脱。n n5.6.2 5.6.2 拖尾峰的判断和处理（对称性大于拖尾峰的判断和处理（对称性大于1.21.2）n n1 1 色谱柱柱头塌陷，有死体积，柱效明显下降，所有峰都色谱柱柱头塌陷，有死体积，柱效明显下降，所有峰都如此，换柱。如此，换柱。n n2 2
43、色谱柱填料流失，例如色谱柱填料流失，例如C18C18在碱性流动相中，一般是使在碱性流动相中，一般是使用较长时间后造成的，换柱。用较长时间后造成的，换柱。n n3 3 用用C18C18柱分析碱性化合物，可用柱分析碱性化合物，可用BDSBDS柱或未端封尾柱，或柱或未端封尾柱，或在流动相中添加减尾剂（三乙胺等）。在流动相中添加减尾剂（三乙胺等）。n n4 4 过载或超载，有可能在检测器上由于灵敏度差，响应小，过载或超载，有可能在检测器上由于灵敏度差，响应小，办法，减少样品浓度和进样量。办法，减少样品浓度和进样量。n n5 5 保留性太强，出峰太迟，办法，增加洗脱强度。保留性太强，出峰太迟，办法，增加
44、洗脱强度。n n6 6 管路有死体积，或连接管路太长，或在管路中有保留。管路有死体积，或连接管路太长，或在管路中有保留。n n7 7 分析体系不合理，如苯基多磺酸类的化合物在酸性的分析体系不合理，如苯基多磺酸类的化合物在酸性的有机相中分离，会出现正三角形的峰，解决办法，用有机相中分离，会出现正三角形的峰，解决办法，用离子对试剂，改变离子对试剂，改变pHpH。n n8 8 在分离过程中，可能发生结构变化，或存在结构互变，在分离过程中，可能发生结构变化，或存在结构互变，办法，用其它分析体系。办法，用其它分析体系。n n9 9 分离不完全，后面带有小峰，采用梯度或改变流动相。分离不完全，后面带有小峰
45、，采用梯度或改变流动相。n n10 10 样品溶解体系同流动相不匹配，样品在柱子中析出。样品溶解体系同流动相不匹配，样品在柱子中析出。5.7 5.7 色谱双峰的判断色谱双峰的判断n n1 1 柱头或筛板杜塞，污染，处理办法，清洗筛板或对柱头填柱头或筛板杜塞，污染，处理办法，清洗筛板或对柱头填料修补。问题是柱效会下降。料修补。问题是柱效会下降。n n2 2 溶剂极性太强或在二相中差异太大，换溶剂，或减少进样溶剂极性太强或在二相中差异太大，换溶剂，或减少进样量。量。n n3 3 过载，减少进样量，或进样体积。过载，减少进样量，或进样体积。n n4 4 采样频率过快，降低采样频率。采样频率过快，降低
46、采样频率。n n5 5 样品的溶解度，样品难溶于流动相时，会出现。样品的溶解度，样品难溶于流动相时，会出现。n n6 6 存在互变异构现象，双峰基本齐平。存在互变异构现象，双峰基本齐平。n n7 7 样品存在动态反应，如酸与盐（间苯甲酸与间苯甲酸钠），样品存在动态反应，如酸与盐（间苯甲酸与间苯甲酸钠），在特定在特定pHpH条件下会出双峰。条件下会出双峰。n n8 8 确实是二个组分混合在一起，改变流动相体系。确实是二个组分混合在一起，改变流动相体系。5.8 色谱峰变胖的判断和处理n n1 1 死体积增加，如管路和连接管，可能用粗的代替细的，死体积增加，如管路和连接管，可能用粗的代替细的，解决办
47、法，缩短连接管路，用细管。解决办法，缩短连接管路，用细管。n n2 2 柱效降低，色谱柱受损，换柱。柱效降低，色谱柱受损，换柱。n n3 3 流动相不合理，单一如只用甲醇水体系，没有添加改流动相不合理，单一如只用甲醇水体系，没有添加改性剂，性剂，pHpH调节剂，也可能柱子选择有问题。一般除了非调节剂，也可能柱子选择有问题。一般除了非极性化合物外，流动相中建议都加盐等化合物，可以提极性化合物外，流动相中建议都加盐等化合物，可以提高化合物的分离柱效。高化合物的分离柱效。n n4 4 溶解与分离体系不一致，如用乙醇溶解样品在甲醇体溶解与分离体系不一致，如用乙醇溶解样品在甲醇体系中进样，会造成峰位移和
48、峰变宽。系中进样，会造成峰位移和峰变宽。n n5 5 大体积进样，在分析柱中进样超过大体积进样，在分析柱中进样超过100100ulul。n n6 6 柱和仪器匹配不合理，如柱和仪器匹配不合理，如2.12.1mmmm内径的色谱柱（包括一内径的色谱柱（包括一体化的柱子，检测器的死体积问题），其管路要求比较体化的柱子，检测器的死体积问题），其管路要求比较细，细，4.64.6mmmm做的好的，做的好的，2.12.1的就不行。的就不行。n n本人联系地址：本人联系地址：n n华东理工大学分析测试中心华东理工大学分析测试中心 200237 200237 施超欧施超欧n nE-MailE-Mail：n n n nOICQ:40005964OICQ:40005964n n电话：电话：0210216425281264252812，28322832