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1、实用方法的建立第1页，共78页，编辑于2022年，星期五目录目录n n1 1 前言前言n n2 HPLC2 HPLC方法建立的步骤方法建立的步骤n n2.1 2.1 了解样品的有关情况了解样品的有关情况n n2.2 2.2 明确分析目的明确分析目的n n2.3 2.3 样品的预处理与检测样品的预处理与检测n n2.4 HPLC2.4 HPLC分析模式的选择分析模式的选择n n2.5 2.5 色谱条件色谱条件n n2.6 2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理方法的优化，及色谱现象的解析和处理n n2.7 2.7 定性和定量方法的建立及论证定性和定量方法的建立及论证第2页，共78页，编辑于2
2、022年，星期五n n3 3 色谱条件的选择色谱条件的选择n n3.1 3.1 流动相的选择流动相的选择n n3.2 3.2 检测器的选择检测器的选择n n3.3 3.3 样品的溶解及预处理样品的溶解及预处理n n3.4 3.4 样品的进样量样品的进样量n n3.53.5色谱柱的选择及保护与再生色谱柱的选择及保护与再生n n3.6 3.6 泵的选择泵的选择n n3.7 3.7 色谱工作站色谱工作站n n4 4 分析方法建立的实例分析方法建立的实例n n4.1 4.1 等度分析等度分析n n4.2 4.2 梯度方法的建立梯度方法的建立n n4.3 4.3 色谱柱及色谱柱及pHpH的影响的影响第3
3、页，共78页，编辑于2022年，星期五5 5 色谱分析中各种图谱现象的判断和处理色谱分析中各种图谱现象的判断和处理5.1 5.1 基线噪音的产生和处理基线噪音的产生和处理5.2 5.2 基线漂移基线漂移(上漂和下漂上漂和下漂)5.3 5.3 倒峰的产生和消除倒峰的产生和消除5.4 5.4 鬼峰的产生和消除鬼峰的产生和消除5.5 5.5 峰前移和退后的判断峰前移和退后的判断5.6 5.6 前沿峰和拖尾峰的判断前沿峰和拖尾峰的判断5.75.7色谱双峰的判断色谱双峰的判断5.8 5.8 色谱峰变胖的判断和处理色谱峰变胖的判断和处理第4页，共78页，编辑于2022年，星期五1 1 1 1 前言前言前言
4、前言n nHPLCHPLC作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。随着位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。随着HPLCHPLC技术的发展和科技的进步，使得技术的发展和科技的进步，使得HPLCHPLC广泛应用到各个领域。广泛应用到各个领域。n nHPLCHPLC实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要；不能包罗一切知识，实践经验非常重要；HPLCHPLC技能是一个综合性的技能是一个综合
5、性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。第5页，共78页，编辑于2022年，星期五2 HPLC2 HPLC2 HPLC2 HPLC方法建立的步骤方法建立的步骤方法建立的步骤方法建立的步骤第6页，共78页，编辑于2022年，星期五第7页，共78页，编辑于2022年，星期五2.1 2.1 了解样品的有关情况了解样品的有关情况n n首首先先应应对对样样品品有有足足够够的的了了解解，并并明明确确分分析析目目的的（同同一一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。n n样品的重要性质包括：样品的重要性质包括：所含化
6、合物的数目；所含化合物的数目；化学结构（官能团）；化学结构（官能团）；分子量；分子量；UVUV光谱图；光谱图；被测组分在样品中的浓度范围；被测组分在样品中的浓度范围；样品的溶解度、沸点及其稳定性；样品的溶解度、沸点及其稳定性；可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。第8页，共78页，编辑于2022年，星期五n n1 1 1 1 分析大分子、小分子还是生物分子分析大分子、小分子还是生物分子分析大分子、小分子还是生物分子分析大分子、小分子还是生物分子 一般常规的一般常规的HPLCHPLC分析分子量分析分子量20002000以下，大分子一般采用凝胶以下，大分子一般
7、采用凝胶色谱色谱(包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析、疏水层析）、包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析、疏水层析）、生物大分子采用不能变性的色谱体系。生物大分子采用不能变性的色谱体系。n n2 2 2 2 样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物。是系列反应
8、的产物。n n3 3 3 3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。检测的灵敏度等。第9页，共78页，编辑于2022年，星期五n n4 4 4 4 分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物
9、。分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。n n非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采用反相体系。用反相体系。n n弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改性弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改性剂，调节合适的剂，调节合适的pHpH。n n离子化合物可以采用离子交换，也可添加离子对试剂；或者采用反相调离子化合物可以采用离子交换，也可添加离子对试剂；或者采用反相调节节pH pH。n n两性化合物中水溶性差的可采用
10、反相；但在反相出峰快的则考虑离两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的则考虑离子交换；也可考虑衍生后测定。子交换；也可考虑衍生后测定。n n对于极性的糖类物质，可用对于极性的糖类物质，可用NH2NH2柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。则要采用凝胶系统。n n大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物柱子。柱子。n n手性化合物，则要用手性流动相或者采用手性柱。手性化合物，则要用手性流动相或者采用手性柱。第10页，共78页，编辑于2022年，星期
11、五n n5 5 5 5 样品的溶解度、沸点样品的溶解度、沸点样品的溶解度、沸点样品的溶解度、沸点n n样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重要，样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类型。测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类型。n n非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。极性化合物在水和极性溶剂中一般都有一定的溶解度。化合物在水和极性溶剂中一般都有一
12、定的溶解度。n n极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同pHpH下区别可能很下区别可能很大。大。n n从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。n n易挥发性的低沸点的物质在易挥发性的低沸点的物质在ELSDELSD中难以检测。中难以检测。第11页，共78页，编辑于2022年，星期五n n6 6 6 6 样品的稳定性样品的稳定性样品的稳定性样品的稳定性n n如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。n n对光敏感物质，用棕色瓶避光保存，不宜存放过久，随配随做。
13、对光敏感物质，用棕色瓶避光保存，不宜存放过久，随配随做。n n易水解的物质，、要选择合适的溶解溶剂。易水解的物质，、要选择合适的溶解溶剂。n n有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。n n易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节pHpH，如，如PAPPAP（对氨基苯丙酮）的测定。胺类化合物。（对氨基苯丙酮）的测定。胺类化合物。n n产品不稳定的化合物，分析越快越好。产品不稳定的化合物，分析越快越好。第12页，共78页，编辑于2022年，星期五n n7 7 7 7 化合物的化学结构化合物的化
14、学结构化合物的化学结构化合物的化学结构（官能团）（官能团）n n常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有COOHCOOH、OHOH、NH2NH2、SO3HSO3H、ClCl（BrBr）、）、CHOCHO、COCO、CH3CH3、C2H5C2H5、N=NHN=NH、SOSO、SO2SO2、-O-O-等。等。n n亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。n n从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。n n8 8 化合物的化合物的pK p
15、K 值值n n知道知道pKpK值，有助于方法的建立，尤其流动相值，有助于方法的建立，尤其流动相pHpH的选择。的选择。n npKpK的差异是官能团造成的。的差异是官能团造成的。第13页，共78页，编辑于2022年，星期五n n9 UV9 UV光谱图光谱图n n知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有DADDAD则关系不则关系不大。多组分的样品，宜多选几个波长。大。多组分的样品，宜多选几个波长。n n同一样品在不同的流动相及同一样品在不同的流动相及pHpH最大波长可能不一致。最大波长可能不一致。n n有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低紫有双键共轭的结构
16、紫外吸收较大，单键的则在低紫外区有一定的吸收外区有一定的吸收n n10 10 样品的复杂层度样品的复杂层度n n梯度方法分析梯度方法分析n n预处理预处理,分成几个部分分析分成几个部分分析n n痕量物质的富集痕量物质的富集n n总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难度。一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难度。第14页，共78页，编辑于2022年，星期五2.2 2.2 明确分析目的明确分析目的n n1 1 定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？
17、光谱鉴定？谱鉴定？n n2 2 是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组分是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组分析？析？n n3 3 定量分析的准确度和精密度？（主成分在定量分析的准确度和精密度？（主成分在1 12 2）n n4 4 不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等）环境样品等）n n5 5 分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。择。n n6 6 实验室的条件，如实验室的条件，如HPLCHPLC仪器的配置和档次；色谱柱系统；仪器的配
18、置和档次；色谱柱系统；是否有恒温；是否可以做梯度；分析成本；实验室人员的是否有恒温；是否可以做梯度；分析成本；实验室人员的操作技能；方法的移植等等。操作技能；方法的移植等等。第15页，共78页，编辑于2022年，星期五2.3 2.3 样品的预处理与检测样品的预处理与检测n n样品来源的形式样品来源的形式n n1 1 可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）n n2 2 需稀释、需稀释、pHpH缓冲、加内标或其它操作缓冲、加内标或其它操作n n3 3 固体样品选择合适的溶剂固体样品选择合适的溶剂n n4 4 需提取分离的样品需提取分离的样品n n5 5 预
19、处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。质。n n总之，将样品溶于合适的溶液；或者用合适的溶液提取出总之，将样品溶于合适的溶液；或者用合适的溶液提取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意被测组分的稳定性和提取率。被测组分的稳定性和提取率。第16页，共78页，编辑于2022年，星期五2.4 HPLC2.4 HPLC分析模式分析模式n n按照样品的特性分为以下二类：按照样品的特性分为以下二类：n nA A 一般样品一般样品 可采用基本标准的方法。可采用基本标准的方法。n n（中性的、离
20、子的）反相、离子对、正相、离子交换。（中性的、离子的）反相、离子对、正相、离子交换。n nB B 特殊样品特殊样品n n 无机离子、异构体、对映体、生物样品、肽类、核苷酸、大分无机离子、异构体、对映体、生物样品、肽类、核苷酸、大分子、蛋白质、核酸、糖类，合成聚合物。子、蛋白质、核酸、糖类，合成聚合物。第17页，共78页，编辑于2022年，星期五2.5 色谱条件n n色谱条件主要包括以下几个方面：色谱条件主要包括以下几个方面：n n流动相的组成及流速、温度等。流动相的组成及流速、温度等。n n色谱柱的类型色谱柱的类型n n样品处理方法样品处理方法n n检测器的确定和参数检测器的确定和参数n n数
21、据处理数据处理n n方法的稳定性及其它方法的稳定性及其它第18页，共78页，编辑于2022年，星期五2.6 2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理方法的优化，及色谱现象的解析和处理n n优化包括合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，优化包括合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，方法的稳定性，方法的稳定性，n n对出现的各种色谱现象，包括仪器和样品的稳定性等提出切实可行的对出现的各种色谱现象，包括仪器和样品的稳定性等提出切实可行的办法。办法。n n建立合理的数据处理方法等。建立合理的数据处理方法等。第19页，共78页，编辑于2022年，星期五2.7 2.7 定性和定量方法
22、的建立及论证定性和定量方法的建立及论证n n对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定的分析方法。可靠的稳定的分析方法。第20页，共78页，编辑于2022年，星期五3 3 色谱条件的选择色谱条件的选择n n3.1 3.1 流动相的选择流动相的选择n n3.1.1 3.1.1 流动相的试剂类型流动相的试剂类型n n以常见的以常见的HPLCHPLC为例，正相、反向、离子对。为例，正相、反向、离子对。n n正相的试剂有正己烷、环已烷、正庚
23、烷、戊烷、二氯甲烷、正相的试剂有正己烷、环已烷、正庚烷、戊烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六圜，也可加一些极性试剂如三氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六圜，也可加一些极性试剂如乙酸、乙醇、异丙醇、四氢呋喃等乙酸、乙醇、异丙醇、四氢呋喃等n n注意：这些有机试剂的纯度非常重要，一是含水的问题，注意：这些有机试剂的纯度非常重要，一是含水的问题，（水的含量将影响保留时间，重复性差）二是其中芳香环（水的含量将影响保留时间，重复性差）二是其中芳香环杂质对紫外检测的干扰，国产分析纯的试剂一般质量很差，杂质对紫外检测的干扰，国产分析纯的试剂一般质量很差，不能直接用于低波长的紫外检测，需重新处理（用硅胶柱不能直接
24、用于低波长的紫外检测，需重新处理（用硅胶柱过滤其杂质）。最好采用色谱纯的试剂，但成本很高。过滤其杂质）。最好采用色谱纯的试剂，但成本很高。第21页，共78页，编辑于2022年，星期五n n离子对试剂离子对试剂n n对强碱性和酸性的离子化合物，除了采用离子交换色谱外，也对强碱性和酸性的离子化合物，除了采用离子交换色谱外，也可在流动相中添加离子对试剂，用可在流动相中添加离子对试剂，用C18C18柱进行分离。柱进行分离。n n离子对试剂可分为二大类酸性和碱性离子对试剂可分为二大类酸性和碱性n n分离多羧基、磺酸基的化合物一般添加长链的胺盐，如四分离多羧基、磺酸基的化合物一般添加长链的胺盐，如四丁基氢
25、氧化胺、四丁基溴化胺、四丁基氯化胺等。丁基氢氧化胺、四丁基溴化胺、四丁基氯化胺等。n n还可以添加还可以添加Na2SO4Na2SO4等无机盐，调节合适的等无机盐，调节合适的pHpH。n n分离碱性的胺类化合物，一般添加八烷基磺酸钠，十二烷基磺酸分离碱性的胺类化合物，一般添加八烷基磺酸钠，十二烷基磺酸钠等。钠等。第22页，共78页，编辑于2022年，星期五n n反相色谱试剂反相色谱试剂n n有机试剂最主要的是甲醇、乙腈、其他的有四氢呋喃、异丙醇，有机试剂最主要的是甲醇、乙腈、其他的有四氢呋喃、异丙醇，乙醇、二氧六圜很少见到。乙醇、二氧六圜很少见到。n n甲醇优质的分析醇基本可以满足分析，乙腈必须
26、是色谱纯（示甲醇优质的分析醇基本可以满足分析，乙腈必须是色谱纯（示差、蒸发光散射？可以用分析纯），四氢呋喃应用新的，建议差、蒸发光散射？可以用分析纯），四氢呋喃应用新的，建议为色谱纯，也可以自己蒸馏处理。分析纯的为色谱纯，也可以自己蒸馏处理。分析纯的THFTHF少量的添加在少量的添加在高波长勉强可以。高波长勉强可以。n n水理论上要求超纯水，但在实际中，我们认为水理论上要求超纯水，但在实际中，我们认为HPLCHPLCMSMS（飞行时间质谱）和（飞行时间质谱）和HPLCHPLCELSDELSD必须用超纯水。其它的用纯必须用超纯水。其它的用纯水和蒸馏水及类似水质也可以，用优质的桶装蒸馏水、纯水是水
27、和蒸馏水及类似水质也可以，用优质的桶装蒸馏水、纯水是能满足分析要求的。去离子水勉强可以，不能在低波长下使用。能满足分析要求的。去离子水勉强可以，不能在低波长下使用。第23页，共78页，编辑于2022年，星期五n n酸，可添加一定量的无机酸和有机酸。酸，可添加一定量的无机酸和有机酸。n n无机酸有无机酸有H3PO4H3PO4、H2SO4H2SO4、HClO4HClO4，HClHCl中中ClCl对不不锈钢管路有对不不锈钢管路有腐蚀作用，腐蚀作用，HNO3HNO3有氧化性很少见到。一般浓度在有氧化性很少见到。一般浓度在0.1%0.1%，pHpH在在2 23 3之间。之间。n n有机酸有甲酸、乙酸、三
28、氟醋酸、柠檬酸等。有机酸有甲酸、乙酸、三氟醋酸、柠檬酸等。n n弱酸浓度在弱酸浓度在0.50.51010。三氟乙酸是强酸用量同无机酸。三氟乙酸是强酸用量同无机酸。n n加酸的作用一是在低加酸的作用一是在低pH pH 下，抑制被弱酸性物质的电离；延下，抑制被弱酸性物质的电离；延长保留时间抑制拖尾。二是调节流动相的长保留时间抑制拖尾。二是调节流动相的pHpH，起到缓冲作，起到缓冲作用。用。n n注意：流动相的注意：流动相的pHpH一般不能低于一般不能低于2 2，否则将缩短色谱柱的寿命。，否则将缩短色谱柱的寿命。第24页，共78页，编辑于2022年，星期五n n无机盐和有机盐无机盐和有机盐n n种类
29、很多，常用的是钾盐和钠盐。磷酸盐、硫酸盐醋酸盐。种类很多，常用的是钾盐和钠盐。磷酸盐、硫酸盐醋酸盐。n nNa2HPO4,NaH2PO4,K2HPO4,KH2PO4,Na2SO4,NaAC,Na2HPO4,NaH2PO4,K2HPO4,KH2PO4,Na2SO4,NaAC,柠檬酸钠，柠檬酸钠，EDTAEDTA钠。钠。n n胺类试剂胺类试剂n n三乙胺、二乙胺、三乙胺、二乙胺、NH4OHNH4OH等，等，n n类似离子对的作用，在类似离子对的作用，在C18C18中，并能抑制峰的拖尾。其次调中，并能抑制峰的拖尾。其次调节流动相的节流动相的pHpH。n n流动相的选择原则是，非极性的一般有机溶剂和水
30、能解流动相的选择原则是，非极性的一般有机溶剂和水能解决。极性样品，要添加改性剂，并控制决。极性样品，要添加改性剂，并控制pHpH值。离子样品，值。离子样品，C18C18柱用离子对试剂，也可控制柱用离子对试剂，也可控制pHpH值来处理，或者用离子交换值来处理，或者用离子交换树脂。树脂。第25页，共78页，编辑于2022年，星期五n n3.1.2 3.1.2 流动相的平衡流动相的平衡n n甲醇水系统一般比较容易，甲醇水系统一般比较容易，3030分钟内完全可以，短柱时间分钟内完全可以，短柱时间比较快。比较快。n n如果流动相添加离子对试剂，在实际操作中，建议先用一如果流动相添加离子对试剂，在实际操作
31、中，建议先用一定比例的水平衡，定比例的水平衡，1515分钟以上，再换成加离子对试剂的流分钟以上，再换成加离子对试剂的流动相，开始有机相比例可以低些，初步平衡后，调到合动相，开始有机相比例可以低些，初步平衡后，调到合适的浓度。适的浓度。n n如果加酸，相对平衡时间比较快，直接上一般问题不大。如果加酸，相对平衡时间比较快，直接上一般问题不大。n n如果是改性剂，如果是改性剂，pHpH缓冲液，平衡时间取决于缓冲液的浓度和缓冲液，平衡时间取决于缓冲液的浓度和pHpH值，先用水平衡一段时间，再换上缓冲液，浓度低的和值，先用水平衡一段时间，再换上缓冲液，浓度低的和pHpH近中性的时间就比较长，浓度大的时间
32、相对短些。盐的浓度近中性的时间就比较长，浓度大的时间相对短些。盐的浓度一般在一般在0.010.05M0.010.05M之间，过高的盐浓度，在有机相高、温度之间，过高的盐浓度，在有机相高、温度低时易析出，杜塞柱子。低时易析出，杜塞柱子。n n分析完后，先用含水流动相洗去无机盐，再用有机溶剂。分析完后，先用含水流动相洗去无机盐，再用有机溶剂。第26页，共78页，编辑于2022年，星期五3.2 3.2 检测器的选择检测器的选择n n目前常见目前常见HPLCHPLC的检测器有的检测器有UVUV、DADDAD、ELSDELSD、RIRI、MSMS。n n使用最多的是使用最多的是UVUV，主要因为大部分的
33、物质在紫外可见区，主要因为大部分的物质在紫外可见区200200700700，有较强的吸收，一般合成的化合物（含苯环最多）大多数有，有较强的吸收，一般合成的化合物（含苯环最多）大多数有紫外吸收。紫外吸收。n n紫外检测器有单波长和多波长之分，最低可到紫外检测器有单波长和多波长之分，最低可到190nm190nm，高可达，高可达900nm900nm，n n多波长检测器可同时选定几个波长测定多波长检测器可同时选定几个波长测定n n注意不同物质其紫外吸收曲线不一，灵敏度差异极大，同一物质注意不同物质其紫外吸收曲线不一，灵敏度差异极大，同一物质不同的流动相吸收曲线也不一致。不同的流动相吸收曲线也不一致。第
34、27页，共78页，编辑于2022年，星期五n n紫外检测器是使用最多的一种，关键是波长的选择。其一般的紫外检测器是使用最多的一种，关键是波长的选择。其一般的规律如下：规律如下：n n典型的含苯结构的化合物在典型的含苯结构的化合物在254nm254nm，具有共轭结构。一般有，具有共轭结构。一般有几个环，就有几个吸收峰。如果存在对称结构，最大波长几个环，就有几个吸收峰。如果存在对称结构，最大波长往往在往往在230nm230nm以下。以下。n n嘧啶环，杂环类似苯环结构。嘧啶环，杂环类似苯环结构。n n含含COOHCOOH、C=SC=S、C=CC=C都有红移现象，如果共轭则更明显。，一都有红移现象，
35、如果共轭则更明显。，一般选择般选择210210230nm230nm。n n染料其最大波长在可见光区，低紫外吸收反而小，一般从染料其最大波长在可见光区，低紫外吸收反而小，一般从颜色可以判断出。颜色可以判断出。第28页，共78页，编辑于2022年，星期五n nDADDAD二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（512512，10241024）其特点是能进行光谱扫）其特点是能进行光谱扫描，能得到三维的色谱图。描，能得到三维的色谱图。n n其作用除了紫外的功能外（灵敏度低于紫外），并能得到分其作用除了紫外的功能外（灵敏度低于紫外），并能得到分离物质的紫外光谱图，对被分离物质光谱图的比较鉴别峰的离物质的紫外
36、光谱图，对被分离物质光谱图的比较鉴别峰的纯度，有一定的选择性。纯度，有一定的选择性。n n其最大的优点是，在分析时，可避免因波长选择的关系，漏掉其最大的优点是，在分析时，可避免因波长选择的关系，漏掉了一些色谱峰，得到未知物的最大吸收波长。了一些色谱峰，得到未知物的最大吸收波长。n n但检测器的价格比但检测器的价格比UVUV高。高。第29页，共78页，编辑于2022年，星期五n n示差检测器示差检测器n n质量型检测器，主要用于非紫外吸收的物质的检测，如糖、酯类等。质量型检测器，主要用于非紫外吸收的物质的检测，如糖、酯类等。n n灵敏度比紫外低一个数量级，对所有物质响应。对温度敏感，灵敏度比紫外
37、低一个数量级，对所有物质响应。对温度敏感，仪器平衡时间长，不能梯度分析。仪器平衡时间长，不能梯度分析。第30页，共78页，编辑于2022年，星期五n nELSDELSD检测器是检测器是9090年代后期才普及的一种质量型检测器，主要是年代后期才普及的一种质量型检测器，主要是替代替代RIRI检测器，其优点是对所有不挥发性的物质有相应，同其检测器，其优点是对所有不挥发性的物质有相应，同其质量有关，往往呈非线性关系。可进行梯度分析，对不挥发的、质量有关，往往呈非线性关系。可进行梯度分析，对不挥发的、紫外吸收很小的物质效果尤其好。紫外吸收很小的物质效果尤其好。n n但其缺点是，挥发性的物质损失而检测不到
38、、极易氧化的物但其缺点是，挥发性的物质损失而检测不到、极易氧化的物质变质。流动相要求高，不能含有不挥发的盐类，因此流动质变质。流动相要求高，不能含有不挥发的盐类，因此流动相有较大的限制。相有较大的限制。n nELSDELSD目前主要有目前主要有Alltech 2000Alltech 2000（500500），），PL1000PL1000，DDL31 DDL31 和和SEDEX55SEDEX55，6565，7575等，有分流和不分流二大类。等，有分流和不分流二大类。第31页，共78页，编辑于2022年，星期五n n质谱检测器质谱检测器n nHPLCHPLC中的质谱检测器同中的质谱检测器同GCGC
39、中不同，主要有中不同，主要有APCIAPCI和和ESIESI二种，每二种，每种有正离子和负离子二种模式。正离子一般以加种有正离子和负离子二种模式。正离子一般以加NaNa、加钾或、加钾或加氢方式出现。加氢方式出现。n n其它类型的检测器其它类型的检测器第32页，共78页，编辑于2022年，星期五3.3 3.3 样品的溶解及预处理样品的溶解及预处理n n样品的类型前面已经提到，并作了分类。对于复杂的样样品的类型前面已经提到，并作了分类。对于复杂的样品，根据分析的要求和对象，必须有合理的提取方法，品，根据分析的要求和对象，必须有合理的提取方法，溶剂萃取、索氏提取、过层析柱、超声萃取、皂化、衍溶剂萃取
40、、索氏提取、过层析柱、超声萃取、皂化、衍生等，这里不一一谈了。生等，这里不一一谈了。n n对于直接可以溶解进样的样品，这里需要注意以下几点：对于直接可以溶解进样的样品，这里需要注意以下几点：n n被测样品的成分必须全部溶解，除非特意处理。被测样品的成分必须全部溶解，除非特意处理。n n样品溶解的原则是相似相溶，首选流动相，如直接不行，样品溶解的原则是相似相溶，首选流动相，如直接不行，或溶解度低，可先用其他溶剂溶解，再用流动相稀释。或溶解度低，可先用其他溶剂溶解，再用流动相稀释。n n在特殊的情况下，可用流动相相互溶的溶剂溶解样品，并在特殊的情况下，可用流动相相互溶的溶剂溶解样品，并进样，但注意
41、二者极性的差异。否则将得到错误的分析结进样，但注意二者极性的差异。否则将得到错误的分析结果。果。n n易氧化分解的物质易氧化分解的物质,配后立即分析。配后立即分析。第33页，共78页，编辑于2022年，星期五3.4 3.4 样品的进样量样品的进样量n n如果是含量的定量分析，有自动进样器最好，手动进样的如果是含量的定量分析，有自动进样器最好，手动进样的操作要求高，生手往往做的精度差。如果样品溶剂与流动操作要求高，生手往往做的精度差。如果样品溶剂与流动相不一致，极性大时，进样体积不要太大，极易出双峰和相不一致，极性大时，进样体积不要太大，极易出双峰和前沿峰。前沿峰。n n面积归一化法，建议进样量
42、不要太大，尤其在低波长分析面积归一化法，建议进样量不要太大，尤其在低波长分析时，防止溶剂进样峰的的干扰，尤其样品溶剂与流动相相时，防止溶剂进样峰的的干扰，尤其样品溶剂与流动相相差很大时，进样体积必须很小。差很大时，进样体积必须很小。第34页，共78页，编辑于2022年，星期五3.53.5色谱柱的选择及保护与再生色谱柱的选择及保护与再生n n3.51 3.51 色谱柱的选择色谱柱的选择n n首选首选C18C18，或，或C8C8，以，以15cm15cm为佳，可解决为佳，可解决8080的样品分析，柱效的样品分析，柱效应大于应大于5000050000。如有条件采用进口色谱柱。特殊样品用特定的柱。如有条
43、件采用进口色谱柱。特殊样品用特定的柱子。子。n n不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不同柱子比例不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不同柱子比例会不一样。会不一样。n n碱性化合物用碱性化合物用BDSBDS柱，糖用柱，糖用NH2NH2柱。柱。n n不同色谱柱，其合适的不同色谱柱，其合适的pHpH范围不一，一般在范围不一，一般在2.5-7.52.5-7.5之间，有之间，有的色谱柱比较耐碱，的色谱柱比较耐碱，kromasilkromasil可以到可以到1010，而杂化，而杂化 xterra xterra 在在1 112,XDB12,XDB在在 pH 3-11 pH 3-11。n n一体化的柱子也
44、比较耐碱。一体化的柱子也比较耐碱。n n现在新型色谱柱不断出现，虽是现在新型色谱柱不断出现，虽是C18C18类型，但差异会很大。类型，但差异会很大。第35页，共78页，编辑于2022年，星期五n n3.52 3.52 色谱柱的保护、平衡和保存色谱柱的保护、平衡和保存n n纯样品分析不加保护柱也许可以，复杂和天然样品必须加上保纯样品分析不加保护柱也许可以，复杂和天然样品必须加上保护柱（有各种类型），延长分析柱的寿命。护柱（有各种类型），延长分析柱的寿命。n n色谱柱的平衡在流动相中已经提到了，注意流动相的色谱柱的平衡在流动相中已经提到了，注意流动相的pHpH值，过值，过低和过高将损伤柱子。当有机
45、相比例很高时，盐浓度不能太高，低和过高将损伤柱子。当有机相比例很高时，盐浓度不能太高，否则温度低的话，盐析出将引起柱子和管路的杜塞，压力大增。否则温度低的话，盐析出将引起柱子和管路的杜塞，压力大增。n n含盐的流动相在分析完后，应用水洗去盐，再换成有机溶含盐的流动相在分析完后，应用水洗去盐，再换成有机溶剂。剂。n n色谱柱的保存，参照说明书，反相柱一般在甲醇或乙腈色谱柱的保存，参照说明书，反相柱一般在甲醇或乙腈中。中。第36页，共78页，编辑于2022年，星期五n n3.53 3.53 色谱柱的清洗色谱柱的清洗n n用比你使用的流动相更强的溶剂冲洗用比你使用的流动相更强的溶剂冲洗n n对于分析
46、柱每种溶剂至少用对于分析柱每种溶剂至少用25 ml 25 ml 冲洗冲洗n n用没有缓冲盐的流动相用没有缓冲盐的流动相n n100%Methanol 100%Methanol 甲醇甲醇n n100%Acetonitrile 100%Acetonitrile 乙腈乙腈n n100%Isopropanol 100%Isopropanol 异丙醇异丙醇n n7575乙腈乙腈 ：2525异丙醇异丙醇n n100%Methylene Chloride100%Methylene Chloride 二氯甲烷二氯甲烷n n100%Hexane 100%Hexane 已烷已烷n n当用已烷或二氯甲烷柱子时当用已
47、烷或二氯甲烷柱子时,必须先用异丙醇冲洗必须先用异丙醇冲洗,然后再用你的反相流动相然后再用你的反相流动相第37页，共78页，编辑于2022年，星期五n n3.54 3.54 色谱柱的维修色谱柱的维修-物理阻塞物理阻塞n n在安装之前前后测试压力差在安装之前前后测试压力差n n如果柱压太高如果柱压太高,反装色谱柱反装色谱柱,并用并用10-2010-20倍体积的流动相冲倍体积的流动相冲洗色谱柱洗色谱柱,监测压力变化监测压力变化.n n若出现沉淀若出现沉淀,(,(如如:蛋白凝聚、细胞物、聚合物蛋白凝聚、细胞物、聚合物)设法用相设法用相应的可溶性溶剂，如应的可溶性溶剂，如0.1%TFA0.1%TFA80
48、80乙腈，乙腈，6M6M盐酸胍、盐酸胍、THFTHF等）等）n n若还无效，更换过滤片若还无效，更换过滤片第38页，共78页，编辑于2022年，星期五n n3.55 3.55 色谱柱修复和再生色谱柱修复和再生 -化学变化化学变化-I-I由于键合相的水解或硅胶的溶解而造成的色谱柱填料的变化是由于键合相的水解或硅胶的溶解而造成的色谱柱填料的变化是不可逆的。不可逆的。n n由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的清洗使之修复。由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的清洗使之修复。n n梯度洗脱的方式梯度洗脱的方式 (水水 -强有机溶剂强有机溶剂)通常最有效。通常最有效。n n低低 pH pH 流动相
49、流动相,如如 0.1%TFA or 0.01M H3PO4,0.1%TFA or 0.01M H3PO4,也是有效的。也是有效的。（也有使用（也有使用0.01M H2SO40.01M H2SO4的）的）n n升高温度（升高温度（60-8060-80）第39页，共78页，编辑于2022年，星期五n n色谱柱的修复和再生色谱柱的修复和再生 -化学变化化学变化 IIIIn nExample:Example:4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 Flow rate:1 mL/min;Temp:80 F
50、low rate:1 mL/min;Temp:80 A:0.1%TFA in water A:0.1%TFA in water B:0.1%TFA in acetonitrile B:0.1%TFA in acetonitrile 100%A for 30 min.;0-100%B over 30 min.;100%A for 30 min.;0-100%B over 30 min.;Hold 100%B for 30 min.,Return to 100%A in 5 min.Hold 100%B for 30 min.,Return to 100%A in 5 min.Repeat 3 t