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1、第四节 HPLC指纹图谱建立的关键技术要求 一、药材样品来源（中间体和注射剂另有规定） 应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。供试品的取样参照中华人民共和国药典2010年版中规定的中药材取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。按1：10取样。 二、供试品制备 必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。多种有效组分应分别提取制备。 三、参照物的制备 选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。,四、测定方法 包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图
2、谱。注意方法学考察。 1、指纹图谱 第一，指纹图谱记录时间一般为1小时，但应提供2小时的记录图。第二，TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化学成分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。 2、共有指纹峰的标定 采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算指纹的相对保留时间。根据10批次的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。,3、共有指纹峰面积的比值 （1）以参照物峰面积作为1 （要求能出现稳定的峰） ，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标物）。 （2）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求面积相对较大、较为稳定的共有峰
3、）的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。 （3）各共有峰的面积比值必须相对固定。 （4）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积20%的共有峰，其差值不得20%；若20%面积10%共有峰，其差值不得25%； 若面积10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。未达到基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。,4、非共有峰面积 非共有峰总面积不得总面积的10%。 5、方法学考察 （1）稳定性 主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性，确定检测时间。 （2）精密度 主要考察仪器
4、的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3%。 （3）重现性 主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3%。,6、其他注意问题 （1）样品定容 一般制成样品的标示浓度单位为g/ml或mg/ml。 （2）放置 供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。 （3）有效数字 相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小
5、数点后3位。 （4）留样 注意留样的数量不少于实验实际用量的3倍。,（5）参照物 复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照物的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。 （6）量化的含义 是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征上可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量”方面的总体差异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在“量”的相对程度。 （7）相似度软件 2004年SFDA中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件，一般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9-1.0之间为符合要求。,图2 福建太子参HPLC指纹图谱,图1 福建莲子HPL
6、C指纹图谱,第五节 研究实例,丹参HPLC指纹图谱构建 一、药材来源（GAP基地）与鉴定 二、色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸（5：95）为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流速为1ml/min。,四、供试溶液的制备 40目，10批次，各1g（精密称取），蒸馏水提取，趁热过滤，得提取液100ml，加10%盐酸调pH为2，再用乙酸乙酯40ml萃取1次。萃取液浓缩至干，残渣用1ml流动相溶解，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过滤。 五、测定 分别取各批次药材供试品10l，注入HPLC仪，记录1h色谱。 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指
7、纹图谱有良好的相似性。 指纹图谱应有12个特征峰。,相对保留时间/min（特征峰序号） 0.150（1）、0.368（2）、0.437（3）、0.495（4）、0.591（5）、1.000（S）、1.143（6）、1.393（7）、1.627（8）、2.585（9）、2.911（10）3.968（11）。 特征指纹峰面积积分相对比值 0.15230%(1)、0.72(2)、0.19130%(3)、0.29725%(4)、0.046(5)、1.000(S)、0.059(6)、0.038(7)、0.139(8)、0.35425%(9)、0.41125%(10)、0.054(11)。 仪器Agilent HPLC及3D色谱工作站；色谱柱：Zorbax C18（4.6mm250mm）色谱分析柱.,