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1、基因工程专题3 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望目的基因（主要指编码蛋白质的基因）的获取目的基因（主要指编码蛋白质的基因）的获取的常用的方法：的常用的方法：（1）从）从基因文库基因文库中获取目的基因：中获取目的基因：直接从生物体中提取总直接从生物体中提取总DNA，构建基因组文构建基因组文库库，从中调用目的基因；从中调用目的基因；以以mRNA为模板，反转录合成互补的为模板，反转录合成互补的cDNA片段片段,构建构建cDNA文库，从文库，从cDNA文库中
2、获取目文库中获取目的基因；的基因；（2）利用聚合酶链式反应（）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地特异性地扩增所需要的目的基因片段；扩增所需要的目的基因片段；（3）如果基因比较小，基因序列已知，通过）如果基因比较小，基因序列已知，通过化学合成仪用化学合成仪用化学方法直接人工合成化学方法直接人工合成。基因文库的构建基因文库的构建-细胞内总细胞内总DNA的提取和分离程的提取和分离程序序基因文库的构建基因文库的构建-将总将总DNA包含的基因组各片段包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体运载体上，便构成了该生物分别克隆在质粒或噬菌体运载体上，便构成了该生物的基因文库。的基因文库。1.怎样从基因文库中
3、获取所需的目的基因呢？怎样从基因文库中获取所需的目的基因呢？目的基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体目的基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因转录产物上的位置、基因转录产物mRNA，以及基因表达产物以及基因表达产物蛋白质等特性获取目的基因。蛋白质等特性获取目的基因。从基从基因组因组文库文库中获中获取目取目的基的基因存因存在的在的问题问题费费时时费费事事,内内含含子子序序列列。利用反转利用反转录人工合录人工合成互补成互补DNA构构建的建的cDNA文文库中提取库中提取目的基因目的基因-获获取的取的DNA片片段往往是段往往是具有特定具有特定功能的目功能的目的基因的基因基因组文
4、库基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传遗传信：某种生物的基因组的全部遗传遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。若这个群体只个群体即为这种生物的基因组文库。若这个群体只贮存某种生物的基因组的部分遗传信息，则称为部贮存某种生物的基因组的部分遗传信息，则称为部分基因组文库。分基因组文库。cDNA基因文库基因文库：某种生物基因组转录的部分或全部：某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经过逆转录产生的各种经过逆转录产生的各种cDNA片断分别与克隆片断分别与克隆载体重组，贮存在一群受体菌群体中，这样的群体载体重组，贮
5、存在一群受体菌群体中，这样的群体称为称为cDNA基因文库。基因文库。基因文库：基因文库：将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库有这种生物的不同基因，称为基因文库2.利用利用PCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：步骤步骤3延伸延伸步骤步骤1变性变性步骤步骤2退火退火概念：概念：聚合酶链式聚合酶链式反应的缩写，生物反应的缩写，生物体外复制特定体外复制特定DNA片断的核酸合成技片断的核酸合成技术。术。特点：特点：短时间短时间内大量扩增已知核内大量扩
6、增已知核苷酸序列的苷酸序列的DNA片片断，使其数量指数断，使其数量指数式（式（2n）增加。增加。原原理：理：DNA双链的半双链的半保留复制。保留复制。条件：条件：模板、引物、酶、模板、引物、酶、能量、原料、适宜能量、原料、适宜条件等。条件等。过过程程每每一一轮轮聚聚合合酶酶链链式式反反应应可可使使目目的的基基因因片片段段增增加加一一倍倍30轮轮循循环环可可获获得得230（1.07109)个个基基因因片片段段聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）：PCR技术就是在体外中技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。目的基
7、因的技术。加入加入4种物质：种物质：（1）作为）作为模板模板的的DNA序列；序列；（2）与被分离的目的基因两条链各自）与被分离的目的基因两条链各自5端序列相互端序列相互补的补的DNA引物引物（20个左右碱基的短个左右碱基的短DNA单链）；单链）；（3）TaqDNA聚合酶聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和和dCTP）。）。过程：过程：变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：双链双链DNA解链成为单链解链成为单链DNA退火：退火：部分引物与模板的单链部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位的特定互补部位相配对和结合相配对和结合延伸：延伸：以目的基因为模板，以目的
8、基因为模板，合成互补的新合成互补的新DNA链链（第一节完）第一节完）为什么要构建基因文库？为什么要构建基因文库？对于高等真核生物而言，基因组对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大，十分庞大，基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难
9、题，一种可行因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。分离得到目的基因。一般外源一般外源DNA(目的基因目的基因)
10、是不易进入受体细胞的，即是不易进入受体细胞的，即使采用物理化学方法将外源基因导入受体细胞后，也使采用物理化学方法将外源基因导入受体细胞后，也不容易在受体细胞中维持，保持稳定。通过不同途径不容易在受体细胞中维持，保持稳定。通过不同途径能将承载的外源基因或能将承载的外源基因或DNA片断导入受体细胞，并在片断导入受体细胞，并在其中得以维持的其中得以维持的DNA分子称为分子称为DNA克隆载体或基因克隆载体或基因克隆载体。作为克隆载体应该具有什么条件？克隆载体。作为克隆载体应该具有什么条件？1.克隆运载体克隆运载体DNA具有多个限制酶切点具有多个限制酶切点2.能在宿主细胞中保存，或插入染色体中能在宿主细胞中保存，或插入染色体中复制复制3.具有标记基因具有标记基因 4.安全安全