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1、微生物基因工程第六-3 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望6.1 基因表达的机制6.2 基因表达的调控元件6.3 影响外源基因表达的因素6.4 外源蛋白的融合表达及分泌表达6.5 大肠杆菌基因表达系统 6.6 酵母基因表达系统6.7 哺乳动物基因表达系统6.8 外源基因表达产物的分离纯化与检测8 8 外源基因表达产物的分离纯化wA 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则wB 离子交换层析wC 凝胶层析wD 亲和层析wE 膜分离wF 原核生物表达的重组蛋白质
2、量检测A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则w针对不同的产物表达形式采取不同的策略w针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型w多种分离纯化技术的联合运用w合适分离纯化介质的选择w分离纯化过程的规模化针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类
3、型 等电点处于极端区域（pI5 或pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8-8-10-4-4 mol/L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。多种分离纯化技术的联合运用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法
4、时应遵循下列原则：w应选择不同分离纯化机理的方法联合使用w应首先选择能除去含量最多杂质的方法w应尽量选择高效的分离方法w应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段合适分离纯化介质的选择w常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：w对目标蛋白具有较高的分离效率w对目标蛋白不会造成变性w化学性能和机械性能稳定，重复性好w价格低廉分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：w实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）w实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实
5、验室的技术路线不等于生产工艺。B 离子交换层析w离子交换层析的基本原理w离子交换介质的基本性质w离子交换层析的基本操作w离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。离子交换介质的基本性质离子交换剂的基本性能 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时，各成分被
6、洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变ppH使吸附的蛋白质失去电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的离子交换介质的基本性质离子交换剂的分类 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型 可电离的基团 磺酸基（-SO3 3H）磷酸基（-PO3 3H2 2）羧酸基（-COOH）酚羟基（-OH）阴离子交换剂：强碱型和弱碱型离 可电离的基团 伯胺基（-NH2 2）仲胺基（-NHCH3 3）叔胺基（-N(CH3 3)2 2 季胺基（-N+(CH3 3)3 3离子交
7、换介质的基本性质离子交换剂的分类w强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽w弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小w弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱w弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换树脂：最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子
8、交换纤维素：离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大w阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等w阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：w离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（SephadexG）Sephadex的优点如下：w亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小w电离基
9、团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快w既有离子交换作用，又有分子筛效应w因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：常用的离子交换葡聚糖包括：w阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25，Sephadex C-50w阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带DEAE或C
10、M基团的 Sepharose CL-6B、DEAE-Sepharose（阴离子型）和 CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点 尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小因此具有稳定的外形体积。离子交换介质的选择原则 一般而言：w酸性物质用阴离子交换剂分离w碱性物质用阳离子交换剂分离w氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择离子交换层析的基本操作层析柱平衡w平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍w平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速w平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中p
11、H值最重要离子交换层析的基本操作样品进柱w为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%w为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高 交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数C 凝胶过滤层析w凝胶层析的基本原理w凝胶介质的基本性质w凝胶层析的基本操作w凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能
12、进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢 鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。凝胶介质的基本性质葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升。葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解。湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温。Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤。凝胶介质的基本性质琼脂糖凝胶 琼脂
13、糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比）和Bio-Gel-A等（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106 6代表排阻限度。当温度高于50时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。凝胶介质的基本性质w聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯
14、酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）凝胶介质的选用原则组别分离 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用SephadexG-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用SephadexG-10、G-15、Bio-Gel P-2或P-4凝胶介质的选用原则分级分离 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种
15、分离叫分级分离,该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。凝胶层析的基本操作w层析柱平衡 平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速 注意凝胶的断层和气泡w操作压控制 平衡和洗脱时应维持流速恒定 恒定的操作压是恒流的先决条件凝胶层析的基本操作进样体积上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：w进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%w进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好D 亲和层析w亲和层析
16、的基本概念w亲和层析载体的性质与选择w亲和层析配基的性质与选择w亲和层析的基本操作亲和层析的基本概念亲和层析的基本特点 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：w纯化过程简单、迅速，且分离效率高w特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子w纯化倍数大，产物纯度高w必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制亲和层析的基本概念具有特异性亲和作用的生物分子w抗原与抗体wDNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)w酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子w激素或药物与其受体w维生素于其特异性结合蛋
17、白w糖蛋白与其相应的植物凝集素亲和层析的基本概念亲和层析的基本原理w亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂w当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出w然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的选择w具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过w具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速w具有惰性，尽量减少非专一性吸附w具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联w在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学
18、稳定性亲和层析载体的性质与选择常用的亲和层析载体w纤维素w葡聚糖凝胶w琼脂糖凝胶w聚丙烯酰胺凝胶w其它新型载体亲和层析配基的性质与选择亲和层析配基的选择w纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力w但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性w配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力亲和层析配基的性质与选择配基的偶联w酸酐法wN-取代羟基琥珀酰亚胺法w叠氮化作用w还原性烷基化合物（西夫碱）的形成亲和层析的基本操作非专一性洗脱 通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度
19、等使与固定配基结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低亲和层析的基本操作专一性洗脱w使用特异的配基作为洗脱剂w使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物亲和层析的基本操作特殊性洗脱 亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法。E
20、 膜分离w膜分离的基本原理w分离膜的主要性能w影响膜分离的因素膜分离的基本原理膜分离的基本定义 膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。膜分离是利用具有一定选择性透过特性的介质进行物质的分离纯化，它是一种物质被透过或被截留的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的。膜分离的基本原理膜分离的特点w分子级别的分离过程，分离效率高w不涉及相变，能耗低，运行成本低w膜分离为单纯物理变化，无二次污染膜分离的基本原理膜分离过程的重要参数w分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制w物质通过分离膜的速度：是
21、物质分离的第二机制w膜分离过程的推动力：静压力差、浓度差、电位差膜分离的基本原理膜分离的主要类型 根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可分成下列几类：w透析（Dialysis DS）w反渗透（Reverse osmosis RO）w超滤（Uitrfiltration UF）w微滤（Microfitration MF）w电渗析（Electrodialysis EI）膜分离的基本原理膜分离的主要类型透析（Dialysis DS）透析过程使用一种只透过溶剂而不透过溶质的膜，一般称为理想的半透膜。当把溶剂和溶液（或把两种不同浓度的溶液）分别置于此两侧时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向
22、溶液（或从低浓度向高浓度）一侧流动，这种现象叫渗透。膜分离的基本原理膜分离的主要类型反渗透（Reverse osmosis RO）反渗透其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、苦咸水淡化和产纯水制备等方面膜分离的基本原理膜分离的主要类型超滤（Uitrfiltration UF）超滤是一种根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围1nm-0.1m，相应的截留分子量范围从500到100万左右。分离膜的基本性能膜的化学物理性能 分离膜
23、是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离透过性能和化学物理性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电性能、毒性、机械强度等。分离膜的基本性能膜的分类按膜的孔径大小分类：w微滤膜 0.025-14mw超滤膜 0.001-0.02mw反渗透膜 0.0001-0.001mw纳米过滤膜平均孔径 2nm分离膜的基本性能膜的分类按膜的结构分类：w对称性膜 膜截面上的孔道结构均匀 传质阻力大，透过通量低，易污染、难清洗w不对称性膜 由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成 传质阻力小，透过通量高，被广泛使用分离膜的基本性能膜的分类按膜的材料
24、分类：w天然高分子膜 醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素w合成聚合物膜 聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物w无机材料膜 陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素 将膜固定在合适的支撑物上即构成膜组件，商品化的膜组件有：管式、板式、螺旋圈式、中空纤维（毛细管）影响膜分离的因素影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：w溶质在膜孔内吸附w溶质在膜表面沉淀或结晶造成膜污染的主要原因是：w蛋白质在不同pH条件下所带电荷对膜电荷的相互作用w无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜w膜分离过程中体系的粘度增大会污染膜F 原核生物表达的重组蛋白质量检测 工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制指标包括：w重组蛋白的鉴别（序列）w重组蛋白的纯度（杂质的类型）w重组蛋白的活性（检测方法）w重组蛋白的安全性w重组蛋白的稳定性w重组蛋白的一致性（构象与构型）