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1、国家自然科学基金课题设计和申请书撰写 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望p面上项目面上项目是国家自然科学基金研究项目体系中的主要部分，是国家自然科学基金研究项目体系中的主要部分，其定位是全面均衡布局，瞄准科学前沿，促进学科发展，激励其定位是全面均衡布局，瞄准科学前沿，促进学科发展，激励原始原始创新创新；支持从事基础研究的科学技术人员在国家自然科学；支持从事基础研究的科学技术人员在国家自然科学基金资助范围内自由选题，开展基金资助范围内自由选题，开展创新创
2、新性的科学研究，力图通过性的科学研究，力图通过研究得到研究得到新新的发现或取得重要进展。鼓励开展具有前瞻性、勇的发现或取得重要进展。鼓励开展具有前瞻性、勇于于创新创新的探索性研究工作；注重保护非共识项目，支持探索性的探索性研究工作；注重保护非共识项目，支持探索性较强、风险性较大的较强、风险性较大的创新创新研究。研究。创新贯穿于整个科学研究活动创新贯穿于整个科学研究活动医学研究的创新医学研究的创新基础理论研究基础理论研究以问题为导向：实现理论创新以问题为导向：实现理论创新临床技术研究临床技术研究以需求为导向：实现技术创新、集成创新以需求为导向：实现技术创新、集成创新基础理论研究基础理论研究一项肿
3、瘤信号途径（分子）的研究一项肿瘤信号途径（分子）的研究人类健康：人类生存、经济发展、社会稳定人类健康：人类生存、经济发展、社会稳定肿瘤：对生命的威胁肿瘤：对生命的威胁肿瘤细胞肿瘤细胞/肿瘤微环境细胞肿瘤微环境细胞细胞的产生、增殖、凋亡、分化、迁移、侵袭细胞的产生、增殖、凋亡、分化、迁移、侵袭信号途径：某个信号途径的意义和信号途径：某个信号途径的意义和CrosstalkCrosstalk个别分子：某个分子的意义和分子间相互作用个别分子：某个分子的意义和分子间相互作用例如：降低例如：降低Survivin对肿瘤进行基因治疗对肿瘤进行基因治疗原理原理Survivin降低能否抑制肿瘤？为什么（肿瘤细胞过
4、表达降低能否抑制肿瘤？为什么（肿瘤细胞过表达Survivin吗）吗）？机制是什么？机制是什么？方案可行性方案可行性输送系统？表达方法？靶向措施？实验研究模型？疗效观察指标？输送系统？表达方法？靶向措施？实验研究模型？疗效观察指标？实施后果实施后果体外模型中的效果？实验动物模型中的效果？临床观察中的效果？体外模型中的效果？实验动物模型中的效果？临床观察中的效果？临床技术研究临床技术研究工程问题转化为理论问题：研究发明的原理、方案可行性、工程问题转化为理论问题：研究发明的原理、方案可行性、实施后果实施后果申请书内容的构思申请书内容的构思找到一个问题：立论依据找到一个问题：立论依据工作中遇到的问题工
5、作中遇到的问题?社会公众关心的热点社会公众关心的热点?读书思考的结果读书思考的结果?规划出一个解决问题的逻辑方案：研究内容规划出一个解决问题的逻辑方案：研究内容 现象的确认：形态变化、基因表达的观察，临床病例对照研究现象的确认：形态变化、基因表达的观察，临床病例对照研究机制的解析：细胞、信号途径、分子机制的解析：细胞、信号途径、分子假说的验证：转染、假说的验证：转染、KO、临床应用、临床应用建立了可靠的研究信誉和资质：研究基础和条件建立了可靠的研究信誉和资质：研究基础和条件个人背景：前期研究业绩个人背景：前期研究业绩研究团队研究团队拟定题目（反映核心科学问题）拟定题目（反映核心科学问题）制定写
6、作提纲制定写作提纲确定研究目标内容确定研究目标内容（如何解决核心科学问题？）（如何解决核心科学问题？）设计立论依据设计立论依据（为什么是核心科学问题？）（为什么是核心科学问题？）建立基础和团队建立基础和团队（凭什么解决核心科学问题？）（凭什么解决核心科学问题？）怎么撰写？怎么撰写？面上项目报告正文撰写提纲面上项目报告正文撰写提纲（一）立项依据与研究内容：（一）立项依据与研究内容：1 1、项目的立项依据、项目的立项依据2 2、项目的研究内容、研究目标、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题以及拟解决的关键科学问题3 3、拟采取的研究方案及可行性分析、拟采取的研究方案及可行性分析4 4
7、、本项目的特色与创新之处。、本项目的特色与创新之处。5 5、年度研究计划及预期研究结果、年度研究计划及预期研究结果（二）研究基础与工作条件（二）研究基础与工作条件1 1、工作基础、工作基础2 2、工作条件、工作条件3 3、申请人简介、申请人简介4 4、承担科研项目情况、承担科研项目情况5 5、完成自然科学基金项目情况、完成自然科学基金项目情况（三）经费申请说明（三）经费申请说明（四）其他附件清单（四）其他附件清单要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出摘摘 要要整个申请书的提纲：整个申请书的提纲：400400字，字，4 4层意思，句句层意思，句句切题，不能出
8、错！切题，不能出错！科学问题：科学问题：xxxxxx是是xxxxxx，但是存在，但是存在xxxxxx问题。问题。基本思路：文献和我们以往的研究工作表明，基本思路：文献和我们以往的研究工作表明，xxxx可能是可能是xx.xx.基本研究内容：本课题拟基本研究内容：本课题拟xxx,xxx,xxxxxx,xxx,xxx。主要研究意义：这些研究具有主要研究意义：这些研究具有xxxx理论意义和理论意义和xxxxxx实际意义。实际意义。NotchNotch信号途径通过信号途径通过miRNAmiRNA调控神经调控神经干干/祖细胞的增殖和分化祖细胞的增殖和分化在哺乳类神经发育中，神经干细胞（在哺乳类神经发育中，
9、神经干细胞（NSCNSC）以特定的时空顺序进）以特定的时空顺序进行增殖、分化和迁移，最终形成具有高级结构和功能的神经系统。行增殖、分化和迁移，最终形成具有高级结构和功能的神经系统。大量文献和我们最近发表的研究证明，经典大量文献和我们最近发表的研究证明，经典NotchNotch途径对途径对NSCNSC的增的增殖和分化发挥关键调控作用，但其下游分子和调控机制尚不完全殖和分化发挥关键调控作用，但其下游分子和调控机制尚不完全清楚。清楚。我们最近在我们最近在NotchNotch途径关键转录因子途径关键转录因子RBP-JRBP-J条件性基因剔除条件性基因剔除小鼠用神经球培养对比了正常和小鼠用神经球培养对比
10、了正常和NotchNotch信号阻断的信号阻断的NSCNSC的的miRNAmiRNA表表达谱，鉴定出一组在正常和达谱，鉴定出一组在正常和NotchNotch缺陷缺陷NSCNSC中差异表达的中差异表达的miRNAmiRNA，并对其中个别分子在并对其中个别分子在NotchNotch信号调控信号调控NSCNSC中的作用进行了初步探讨。中的作用进行了初步探讨。本课题拟在此基础上，深入研究本课题拟在此基础上，深入研究NotchNotch信号调控这组候选信号调控这组候选miRNAmiRNA的的分子机制；揭示候选分子机制；揭示候选miRNAmiRNA在在NSCNSC增殖分化中的作用和机制；阐明增殖分化中的作
11、用和机制；阐明候选候选miRNAmiRNA在在NotchNotch信号途径中的功能意义。信号途径中的功能意义。这些研究可以拓展对这些研究可以拓展对NotchNotch信号调控机制的认识，还可以发现神经发育中信号调控机制的认识，还可以发现神经发育中NSCNSC增殖分化增殖分化调控的新机制，具有重要的理论意义。调控的新机制，具有重要的理论意义。（一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）字）立项依据立项依据1、研究意义、研究意义2、国内外研究现状及发展动态分析、国内外研究现状及发展动态分析3、主要参考文献目录、主要参考文献目录常见问题：常见问题：1、写成了国内外研究现状
12、、写成了国内外研究现状2、提炼不出来自己的研究有什么意义、提炼不出来自己的研究有什么意义3、完全没有阐述本课题的基本研究内容，所以无从阐述本研究的意义、完全没有阐述本课题的基本研究内容，所以无从阐述本研究的意义1、研究意义：、研究意义：结合科学研究发展趋势来论述科学意义结合科学研究发展趋势来论述科学意义结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述应用前景结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述应用前景放大、修改版的摘要：放大、修改版的摘要：（1）从更广泛的层面上对研究意义进行阐述，如某种疾病对公众健康的影响，）从更广泛的层面上对研究意义进行阐述，如某种疾病对公众健康
13、的影响，某一个现象或问题对学科发展的意义，等等某一个现象或问题对学科发展的意义，等等（2）通过分析现在存在的问题、自己的前期结果，引伸到自己的研究内容）通过分析现在存在的问题、自己的前期结果，引伸到自己的研究内容（3）针对这些问题，本课题开展的研究内容）针对这些问题，本课题开展的研究内容（4）本课题的研究有什么科学意义、应用前景）本课题的研究有什么科学意义、应用前景 脊椎动物神经系统的高度有组织的结构是其正常行使功能的基础，而正常有序的发育则是其复杂结构形成的基础。哺乳类的中枢神经系统（CNS）是从定位于神经管管壁靠近管腔侧（发育中的室管膜带）的神经干细胞（NSC，neural stem ce
14、lls）增殖、分化而来。NSC可以通过对称分裂来增殖，还可通过不对称分裂在自我更新的同时产生中间神经祖细胞（INP，intermediate neural progenitors）。神经祖细胞则在细胞内、外信号的共同作用下在不断通过对称分裂而增殖的同时沿着特定的路线进行迁移，并不断分化产生各种类型的子代神经细胞，再组装成不同的神经结构而发挥其功能。正确理解NSC维持自身增殖、NSC向下游细胞的分化、以及进一步迁移、分化成成熟神经细胞和形成神经连接的分子机制，不仅对于了解神经系统的结构形成十分重要，也对认识包括人类的高级神经活动在内的神经系统的功能以及相关人类疾病的发病机制具有重要的意义。Not
15、ch信号途径是神经发育调节的关键信号途径之一。最近，我们用小鼠Nestin基因增强子建立了在NSC中特异表达重组酶Cre的转基因小鼠（Zhang Q et al.Neurosci Lett.2005;379:90-95），并与本研究室以往建立的RBP-J-Floxed小鼠交配得到了在NSC特异剔除RBP-J的条件性基因剔除小鼠。表型分析发现从从RBP-J条件性基因剔除小鼠胚胎分离培养的神经球（条件性基因剔除小鼠胚胎分离培养的神经球（Neurosphere）具有明显）具有明显降低的自我更新能力和增强的分化潜能，并且向神经元的方向分化增加（降低的自我更新能力和增强的分化潜能，并且向神经元的方向分化
16、增加（Gao F et al.Mol Cell Neurosci.2009;40:442-450）；体外神经元培养还发现）；体外神经元培养还发现RBP-J缺陷神经元的神经突起生长减少缺陷神经元的神经突起生长减少（Gao F et al.Unpublished）。）。然而，这些工作和国际上本领域的相关研究都还未能阐明Notch信号途径是通过哪些下游分子、如何调控神经干细胞的增殖和分化的。近几年发现的microRNA（miRNA）在脊椎动物神经系统中表达丰富并具有一定时空特性。多项研究已经提示miRNA参与了NSC的分化。Notch信号途径作为神经系统发育调控的关键信号途径之信号途径作为神经系统发
17、育调控的关键信号途径之一，是否可通过调控某些一，是否可通过调控某些miRNA影响影响NSC及其下游细胞的增殖分化？及其下游细胞的增殖分化？针对这一问题，本课题组利用神经球悬浮培养法从RBP-J剔除小鼠和对照小鼠分别培养了NSC，利用miRNA表达芯片对比分析，结合生物信息学分析和文献回顾，获得了一组（7个）在RBP-J剔除神经球和对照神经球之间有明显差异表达并可能具有潜在功能的miRNA（见工作基础见工作基础）。本项目拟在此基础上检测这些候选miRNA在小鼠CNS发育过程中的表达，在培养的细胞中和小鼠体内分析候选miRNA对NSC自我更新、增殖和分化的调控作用，继而进一步深入研究其调控机制，尤
18、其与Notch信号的关系。这些研究：可以可以明确参与调控明确参与调控NSC自我更新和分化的新的自我更新和分化的新的miRNA，并初步阐明其作用的机制；，并初步阐明其作用的机制；就我们掌握的文献，就我们掌握的文献，到目前为止还没有报道在哺乳类到目前为止还没有报道在哺乳类Notch信号可以通过信号可以通过miRNA调控发育过程，所以本课题有望揭示调控发育过程，所以本课题有望揭示Notch信号调控中枢神经系统发育的新机制，信号调控中枢神经系统发育的新机制，具有重要意义。2、国内外研究现状及发展动态分析：、国内外研究现状及发展动态分析：领域的基本知识介绍领域的基本知识介绍(Biology)所研究的问题
19、的研究现状，包含自己发表的论文所研究的问题的研究现状，包含自己发表的论文(Molecule)以本课题的研究逻辑和研究意义结尾以本课题的研究逻辑和研究意义结尾(Biology)围绕课题的思路进行综述，层次清晰，步步提示围绕课题的思路进行综述，层次清晰，步步提示存在问题存在问题，观点鲜明，把，观点鲜明，把自己的研究思路暗含在对文献的综述中，自己的研究思路暗含在对文献的综述中，最后用自己的研究提出最后用自己的研究提出解决办法解决办法常见问题：常见问题：1、综述不全面、没有很好地阅读、忽略了重要进展（尤其是国内专家）、综述不全面、没有很好地阅读、忽略了重要进展（尤其是国内专家）2、逻辑思路不清晰，没有
20、围绕一个中心问题进行综述、逻辑思路不清晰，没有围绕一个中心问题进行综述3、自说自话，只是以自己的前期研究为依据、自说自话，只是以自己的前期研究为依据4、过多引用未发表的、过多引用未发表的Data5、以未见报道为依据（在其他的肿瘤已有结论，现在换个肿瘤）、以未见报道为依据（在其他的肿瘤已有结论，现在换个肿瘤）国内外研究现状国内外研究现状NSC增殖分化调控的一般知识增殖分化调控的一般知识1、Notch信号途径及其对信号途径及其对NSC增殖分化的调控增殖分化的调控作用：作用：1.1Notch信号途径信号途径1.2Notch信号对神经分化的调控信号对神经分化的调控2、miRNA对对NSC/INP增殖分
21、化的调控作用：增殖分化的调控作用：2.1miRNA在中枢神经系统的表达在中枢神经系统的表达 2.2miRNA对对NSC分化命运的选择具有十分重要的分化命运的选择具有十分重要的作用作用3、Notch途径和途径和miRNA的关系的关系4、Summary3、主要参考文献：、主要参考文献：(显示科学态度显示科学态度!)准确准确及时更新及时更新格式规范一致格式规范一致与正文对应与正文对应国内科学家、中文论文引用国内科学家、中文论文引用Yao-Chun Wang,Fei He,Xiao-Wei Liu,Guang-Ying Dong,Hong-Yan Qin,Xing-Bin Hu,Fan Feng,Mi
22、n-Hua Zheng,Liang Liang,Lei Feng,Ying-Min Liang,Hua Han.Notch signaling determines the M1 versus M2 polarization of macrophages in anti-tumor immune responses.Cancer Res.2010;70:4840-4849.(封面标题封面标题)研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标、研究内容和拟解决的关键问题（此部分为重点阐述内容）（此部分为重点阐述内容）研究目标：本课题的总体研究目的和达到的程度，要一目研究目标：本课题的总体研究目的和达
23、到的程度，要一目了然。了然。一句话讲出：通过一句话讲出：通过xxx，阐明阐明xxx，为，为xxx奠定基础。奠定基础。常见问题：常见问题：研究目标太大研究目标太大/太小太小研究目标与研究内容混淆研究目标与研究内容混淆研究内容：围绕着上述研究目标，（研究内容：围绕着上述研究目标，（1）打算开展几个方面的实验研究？）打算开展几个方面的实验研究？（2）每个方面都进行哪些实验？）每个方面都进行哪些实验？例如对一个新基因的功能研究：例如对一个新基因的功能研究：1、表达：表达：在生物信息学预测的基础上，进行表达范围分析（在生物信息学预测的基础上，进行表达范围分析（Northern,RT-PCR,原位原位杂交
24、）、细胞内定位分析（免疫荧光染色、融合蛋白表达）杂交）、细胞内定位分析（免疫荧光染色、融合蛋白表达）2、功能：功能：在体外对细胞功能的影响：转染、干扰；增殖、凋亡、分化、迁移、形态变在体外对细胞功能的影响：转染、干扰；增殖、凋亡、分化、迁移、形态变化？体内功能研究：化？体内功能研究：KO？转基因小鼠？病例相关的分析？转基因小鼠？病例相关的分析？3、作用机制：作用机制：转录调控？信号转导？上、下游分子？相互作用蛋白？转录调控？信号转导？上、下游分子？相互作用蛋白？4、表达调控：表达调控：启动子结构？表观遗传修饰？翻译后调控？启动子结构？表观遗传修饰？翻译后调控？常见问题：常见问题：层次条理不清楚
25、：针对一个问题需要做哪几个方面的研究？逻辑关系层次条理不清楚：针对一个问题需要做哪几个方面的研究？逻辑关系内容简繁不得当：（生物信息学、构建质粒；筛选、构建小鼠、转录调控）内容简繁不得当：（生物信息学、构建质粒；筛选、构建小鼠、转录调控）和研究方案混淆：罗列具体的实验步骤和研究方案混淆：罗列具体的实验步骤在前期工作已经获得在前期工作已经获得RBP-JRBP-J基因剔除基因剔除NSCNSC与正常与正常NSCNSC差异差异miRNAmiRNA的基的基础上，检测这些候选础上，检测这些候选miRNAmiRNA在小鼠在小鼠CNSCNS发育过程中的表达特点，在培发育过程中的表达特点，在培养的细胞中和小鼠体
26、内分析重要候选养的细胞中和小鼠体内分析重要候选miRNAmiRNA对对NSCNSC自我更新、增殖和自我更新、增殖和分化的调控作用，继而进一步深入研究其调控机制，尤其与分化的调控作用，继而进一步深入研究其调控机制，尤其与NotchNotch信号的关系，信号的关系，以期明确以期明确miRNAmiRNA参与介导参与介导NotchNotch信号调控信号调控NSCNSC自我更新自我更新增殖和分化的信号通路、作用机制和意义增殖和分化的信号通路、作用机制和意义，为揭示哺乳类中枢神经，为揭示哺乳类中枢神经系统发育的调控机制提供新的实验依据。系统发育的调控机制提供新的实验依据。研究目标：研究目标：1 1、候选、
27、候选miRNAmiRNA在中枢神经系统发育过程中的表达。在中枢神经系统发育过程中的表达。利用利用miRNAmiRNA提取提取和反转录系统明确候选和反转录系统明确候选miRNAmiRNA在不同胎龄小鼠的相关脑区的时空表在不同胎龄小鼠的相关脑区的时空表达特征；利用达特征；利用LNALNA修饰的寡核苷酸探针进行原位杂交修饰的寡核苷酸探针进行原位杂交（Kloosterman,W.P.et al.2006,Nat.Methods.3,27-29Kloosterman,W.P.et al.2006,Nat.Methods.3,27-29），），在体检测候选在体检测候选miRNAmiRNA在中枢神经系统内的
28、时空表达情况。在中枢神经系统内的时空表达情况。2 2、候选、候选miRNAmiRNA对对NSCNSC增殖分化的调控作用。增殖分化的调控作用。利用生物合成的利用生物合成的miRNA miRNA mimicsmimics和和inhibitsinhibits分别转染神经细胞系细胞和培养的原代神经球分别转染神经细胞系细胞和培养的原代神经球（Sathyan,P.et al.2007,J.Neurosci.27,8546-8557Sathyan,P.et al.2007,J.Neurosci.27,8546-8557），），初步观察候选初步观察候选miRNAmiRNA对对NSCNSC增殖分化等生物学行为的
29、影响；利用病毒增殖分化等生物学行为的影响；利用病毒感染体系构建含有感染体系构建含有EGFPEGFP的针对候选的针对候选miRNAmiRNA的过表达载体，以及反义的过表达载体，以及反义序列的表达载体，感染原代培养的神经球，观察序列的表达载体，感染原代培养的神经球，观察NSCNSC增殖分化等细增殖分化等细胞生物学行为的变化；用胚胎电转染的方法将上述过表达载体和反胞生物学行为的变化；用胚胎电转染的方法将上述过表达载体和反义载体转染至不同阶段小鼠胚胎的室管膜（下）带，结合义载体转染至不同阶段小鼠胚胎的室管膜（下）带，结合NSCNSC增殖增殖分化相关的标记物的免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察被转分化
30、相关的标记物的免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察被转染的染的NSCNSC的变化。的变化。研究内容：研究内容：3 3、候选、候选miRNAmiRNA调控调控NSCNSC增殖分化的分子机制。增殖分化的分子机制。首先探讨差异表达的首先探讨差异表达的miRNAmiRNA与与NotchNotch信号的关系，主要研究这些差异信号的关系，主要研究这些差异miRNAmiRNA是否是是否是NotchNotch信信号途径的下游分子，包括其启动子区的生物信息学分析（号途径的下游分子，包括其启动子区的生物信息学分析（RBP-JRBP-J或或HesHes家族识别序列的存在与否），以及用体外和体内实验方法证实家族识别序
31、列的存在与否），以及用体外和体内实验方法证实这些这些miRNAmiRNA的表达是否受的表达是否受Notch/RBP-JNotch/RBP-J信号的调控。其次是借助生物信号的调控。其次是借助生物信息学方法分析信息学方法分析miRNAmiRNA靶分子，并综合使用靶分子，并综合使用LuciferaseLuciferase报告基因实报告基因实验、基因转染和定量验、基因转染和定量RT-PCRRT-PCR、定位突变等方法分析、定位突变等方法分析miRNAmiRNA对靶分子对靶分子的调控作用，再根据靶分子的特征进行更加深入的分子机制的研究。的调控作用，再根据靶分子的特征进行更加深入的分子机制的研究。4 4、
32、体内验证、体内验证NotchNotch途径和候选途径和候选miRNAmiRNA之间的调控关系。之间的调控关系。对于经过分对于经过分子水平验证的子水平验证的miRNAmiRNA，用过表达或是抑制表达的病毒载体来感染，用过表达或是抑制表达的病毒载体来感染RBP-JRBP-J剔除胚胎小鼠，观察我们前期观察到的剔除胚胎小鼠，观察我们前期观察到的NSCNSC增殖分化异常增殖分化异常(Gao(Gao F,et al.Mol Cell Neurosci.2009,40:442-450)F,et al.Mol Cell Neurosci.2009,40:442-450)是否能够被是否能够被挽救，以验证挽救，以
33、验证NotchNotch途径和候选途径和候选miRNAmiRNA两者在体内的调节关系。两者在体内的调节关系。研究内容：研究内容：拟解决的关键科学问题：拟解决的关键科学问题：（1）什么是自己研究的领域的关键科学问题？为）什么是自己研究的领域的关键科学问题？为什么？什么？（2）本研究解决这个问题的逻辑思路是什么？解）本研究解决这个问题的逻辑思路是什么？解决这个问题有何意义？决这个问题有何意义？本课题拟回答的关键科学问题：本课题拟回答的关键科学问题：本课题拟回答的根本科学问题是本课题拟回答的根本科学问题是Notch信号调控信号调控NSC增殖分化的分子机制问题。文献报道和我们的增殖分化的分子机制问题。
34、文献报道和我们的前期工作得出了前期工作得出了Notch信号调控信号调控NSC的一致结论，但进一步的分子的一致结论，但进一步的分子机制是有待回答的进一步问题。而机制是有待回答的进一步问题。而Notch通路和通路和miRNA分子在分子在NSC发育过程中都发挥着重要的作用，但是他们之间是否存在发育过程中都发挥着重要的作用，但是他们之间是否存在cross-talk？如果有，各自在调控网络中又分别扮演着什么角色？两者之？如果有，各自在调控网络中又分别扮演着什么角色？两者之间是如何相互影响相互调控的？这种相互调控最终对间是如何相互影响相互调控的？这种相互调控最终对NSC的增殖分的增殖分化又会是怎样的影响？
35、这些调控和调控间的相互作用可能贯穿着神化又会是怎样的影响？这些调控和调控间的相互作用可能贯穿着神经系统发育的全过程。阐明这些调控因素之间的相互作用，不仅对经系统发育的全过程。阐明这些调控因素之间的相互作用，不仅对于我们理解于我们理解NSC发育的基本过程有着重要的意义，而且对于我们将发育的基本过程有着重要的意义，而且对于我们将来利用来利用NSC进行疾病治疗也具有至关重要的意义。本课题前期通过进行疾病治疗也具有至关重要的意义。本课题前期通过miRNA芯片在芯片在Notch途径阻断的小鼠中检测到一组发生改变的途径阻断的小鼠中检测到一组发生改变的miRNA分子，我们拟在此基础上重点观察分子，我们拟在此
36、基础上重点观察Notch途径对途径对miRNA的的调控，以明确这两个在调控，以明确这两个在NSC发育过程中都十分重要的因素之间的相发育过程中都十分重要的因素之间的相互作用，以及他们的相互作用对于互作用，以及他们的相互作用对于NSC增殖分化的调控。增殖分化的调控。课题设计的原则课题设计的原则对照原则：对照原则：医学研究主要是通过对比实验组和对照组的差别来回医学研究主要是通过对比实验组和对照组的差别来回答干预因素的效应，所以完美的对照组设计十分重要答干预因素的效应，所以完美的对照组设计十分重要重复原则：重复原则：医学研究是设计的实验，差别的真实性需要经过统计医学研究是设计的实验，差别的真实性需要经
37、过统计学检验，所以保质保量的重复实验是发现真理的保证学检验，所以保质保量的重复实验是发现真理的保证拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方案及可行性分析（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）研究方法：用研究方法：用xxx观察分析观察分析xxx；用；用xxx观察分析观察分析xxx；技术路线：最好图示一个总体技术路线技术路线：最好图示一个总体技术路线实验研究方案：结合技术路线，把研究内容里的各项实验具体化（步骤、实验研究方案：结合技术路线，把研究内容里的各项实验具体化（步骤、分组、分组、对照、重复）对照、重复）关键技术说明：课题可
38、能遇到的技术难点，需加以说明关键技术说明：课题可能遇到的技术难点，需加以说明常见问题：常见问题：（1）技术路线图太复杂）技术路线图太复杂（2）研究方案与研究内容不吻合，只是简单地罗列方法和）研究方案与研究内容不吻合，只是简单地罗列方法和Protocol（3）研究方案过于繁琐或过于简单，尤其是过分简单）研究方案过于繁琐或过于简单，尤其是过分简单（4）方案不完善甚至出错：该做的实验没有写；用人组织样品杂交小鼠芯片；）方案不完善甚至出错：该做的实验没有写；用人组织样品杂交小鼠芯片；购买某公司的试剂，而该公司已倒闭；写的是别的课题的方案；购买某公司的试剂，而该公司已倒闭；写的是别的课题的方案；（5）关
39、键技术需要说明：基因剔除小鼠；关键抗体；）关键技术需要说明：基因剔除小鼠；关键抗体；可行性分析：可行性分析：（1）理论可行性）理论可行性（2）条件可行性）条件可行性（3）研究基础可行性、）研究基础可行性、1）miRNA靶基因的筛选将可能是本课题面临的重要的技术问题。靶基因的筛选将可能是本课题面临的重要的技术问题。miRNA的靶分子预测的靶分子预测显示动物全部基因中有多于显示动物全部基因中有多于1/3的基因都可能受到的基因都可能受到miRNA的调控（的调控（Lewis BP et al.2005,Cell.120,1520）。而且一个）。而且一个miRNA可能抑制多个靶分子可能抑制多个靶分子mR
40、NA的翻译，一个的翻译，一个mRNA又又会受到多个会受到多个miRNA的调节（的调节（Bartel DP.2004,Cell.116,281297）。这为候选）。这为候选miRNA靶靶基因的筛选带来很大的困难。因此，充分利用生物信息学分析方法，并结合已知的调节基因的筛选带来很大的困难。因此，充分利用生物信息学分析方法，并结合已知的调节NSC增殖分化的分子信息知识，在本课题中显得十分重要。增殖分化的分子信息知识，在本课题中显得十分重要。2）对候选）对候选miRNA进行体内的进行体内的功能研究也将有一定难度。主要是如何提高特定功能研究也将有一定难度。主要是如何提高特定miRNA在原代培养神经细胞和
41、在体转染在原代培养神经细胞和在体转染的效率。这一点我们拟通过构建病毒载体，来进行原代培养细胞的转染；而在体的转染，的效率。这一点我们拟通过构建病毒载体，来进行原代培养细胞的转染；而在体的转染，我们拟通过构建病毒载体结合胚胎电转染的方法进行。课题组成员郑敏化博士在中国科学我们拟通过构建病毒载体结合胚胎电转染的方法进行。课题组成员郑敏化博士在中国科学院上海神经科学研究所工作期间已经针对本技术接受了专门训练，并已将此方法成功应用院上海神经科学研究所工作期间已经针对本技术接受了专门训练，并已将此方法成功应用于关于视网膜发育的研究（于关于视网膜发育的研究（Zheng et al.2009,Mol Bra
42、in 2:38）。）。关键技术说明：容易让人怀疑的研究内容和方案，需关键技术说明：容易让人怀疑的研究内容和方案，需要特别说明要特别说明项目特色与创新之处项目特色与创新之处项目特色：项目特色：研究过程中的研究思路、目标、内容、方案、关键问题、可行研究过程中的研究思路、目标、内容、方案、关键问题、可行性与现有研究相比有哪些性与现有研究相比有哪些不一样不一样（特色）（特色）具有具有不一样不一样的研究意义？的研究意义？抓住了抓住了不一样不一样的研究问题？的研究问题？从从不一样不一样的角度研究问题？的角度研究问题？采用了采用了不一样不一样的实验平台和方法？的实验平台和方法？创新之处：创新之处：研究结束后
43、会产生哪些研究结束后会产生哪些新知识新知识（创新）（创新）新新理论、理论、新新机制、机制、新新解释、解释、新新功能功能新新分子、分子、新新通路、通路、新新靶点、靶点、新新型相互作用型相互作用新新方法、方法、新新技术、技术、新新疗法、疗法、新新研究平台研究平台特色与创新特色与创新本课题在以往工作的基础上提出本课题在以往工作的基础上提出“Notch信号通过信号通过miRNA调控哺乳类调控哺乳类NSC增殖增殖分化分化”，并在前期工作中筛选到一组在，并在前期工作中筛选到一组在Notch信号途径关键转录因子信号途径关键转录因子RBP-J基因基因剔除后差异表达的剔除后差异表达的miRNA。在此基础上进一步
44、阐明其在。在此基础上进一步阐明其在NSC中的作用及其与中的作用及其与Notch信号的关系。这些研究：信号的关系。这些研究：可以明确参与调控可以明确参与调控NSC自我更新和分化的自我更新和分化的新新的的miRNA，并初步阐明其，并初步阐明其作用的新机制作用的新机制；就我们掌握的文献，虽然已知多种就我们掌握的文献，虽然已知多种miRNA可以调控可以调控Notch信号某些分子的表达，但到目前为止还没有报道在哺乳信号某些分子的表达，但到目前为止还没有报道在哺乳类类Notch信号可以通过信号可以通过miRNA调控发育过程，所以本课题的研究有望揭示调控发育过程，所以本课题的研究有望揭示Notch信号调控中
45、枢神经系统发育的信号调控中枢神经系统发育的新机制新机制，具有明显的理论创新性。，具有明显的理论创新性。本课题组研究本课题组研究Notch信号途径功能的突出特色在于课题组建立的信号途径功能的突出特色在于课题组建立的RBP-J条件性条件性基基因剔除小鼠平台因剔除小鼠平台。由于。由于RBP-J是是Notch四种受体的共同下游分子，较之以往四种受体的共同下游分子，较之以往Notch1剔除等模型，剔除等模型，RBP-J条件性剔除的最大优势在于实现经典条件性剔除的最大优势在于实现经典Notch信号的条信号的条件性件性完全阻断完全阻断，全面反映经典，全面反映经典Notch信号途径的调控作用。在此基础上获得候
46、信号途径的调控作用。在此基础上获得候选选miRNA，在本研究中经过细胞和分子水平的研究后再在，在本研究中经过细胞和分子水平的研究后再在RBP-J条件性剔除小条件性剔除小鼠上证实其作用，可以最大限度地获得鼠上证实其作用，可以最大限度地获得Notch-miRNA相互关系的体内证据，有相互关系的体内证据，有明显特色。明显特色。年度研究计划和预期结果年度研究计划和预期结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）年度计划：年度计划：合理划分：合理划分：四年四年 研究内容：分散在四年，不能只写题目研究内容：分散在四年，不能只写题目国际合作
47、与交流计划国际合作与交流计划预期结果：预期结果：1、理论成果：阐明、理论成果：阐明xxx，解决，解决xxx问题问题 2、发表论文、发表论文 3、可能产生的专利、可能产生的专利 4、人才培养、人才培养工工 作作 基基 础础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）相关研究工作积累：相关研究工作积累：项目相关项目相关 已经发表的工作的核心内容已经发表的工作的核心内容 没有发表的实验结果：要有没有发表的实验结果：要有Legend!已取得的研究工作成绩：已取得的研究工作成绩：1、理论成果：获奖、理论成果：获奖 2、发表论文、发表论文 3、已
48、经产生的专利、已经产生的专利 4、人才培养、人才培养按照研究内容的按照研究内容的“故事故事”逻辑归纳总结，突出重点避免罗列逻辑归纳总结，突出重点避免罗列工工 作作 条条 件件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。）1、已经具备的实验条件：全校都可写，注意与研究方法吻合、已经具备的实验条件：全校都可写，注意与研究方法吻合2、尚缺少的实验条件：动物、仪器设备、尚缺少的实验条件：动物、仪器设备解决途径：动物购买合同、
49、仪器设备使用协议、合作协议解决途径：动物购买合同、仪器设备使用协议、合作协议3、国家重点实验室和部门开放实验室、国家重点实验室和部门开放实验室肿瘤生物学国家重点实验室肿瘤生物学国家重点实验室教育部教育部XX重点实验室重点实验室军队军队XX重点实验室重点实验室申请人简历申请人简历包括申请人和项目组主要参与者的学历和研究工作简历，近期已包括申请人和项目组主要参与者的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作者、论著题目、目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作
50、者、论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码等；奖励情况也须期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码等；奖励情况也须详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等申请人和主要参与者：申请人和主要参与者：（1）学历和研究工作简历：主要学历和简历，强调与本课题相关的）学历和研究工作简历：主要学历和简历，强调与本课题相关的（2）论著：）论著：Yao-Chun Wang,Fei He,Xiao-Wei Liu,Guang-Ying Dong,Hong-Yan Qin,Xing-Bin Hu,Fan Feng,Min-Hua Zheng,Liang L