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1、第十二章固相膜免疫测定第十二章固相膜免疫测定第一节第一节 概述概述放射免疫测定放射免疫测定 1960 1960酶免疫测定酶免疫测定 1970 1970荧光免疫测定荧光免疫测定 1980 198019901990化学发光免疫测定化学发光免疫测定 1990 1990膜固相免疫测定膜固相免疫测定 1990 1990标记免疫测定免疫浊度测定免疫浊度测定Ag+Ab AgAb +AbAg+Ab AgAb +Ab标记免疫测定标记免疫测定 Ag+Ab*Ag Ab*+Ab*Ag+Ab*Ag Ab*+Ab*（B B）（F F）免疫测定分类利用抗原抗体反应检测标本中微量物质利用抗原抗体反应检测标本中微量物质抗原抗原
2、+抗体抗体 抗原抗体复合物抗原抗体复合物 Ag+Ag+AbAb Ag*Ag*AbAb免疫测定原理 Ab*Ab*Ab*Ab*Ag+Ag +Ab*Ag+Ag +Ab*Ab Ab Ab Ab固相免疫测定B与F分别多孔性多孔性 毛细管作用毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性高度敏感性易于漂洗易于漂洗 操作简便操作简便固相膜的特点玻璃纤维素玻璃纤维素(fiberglass)膜膜尼龙尼龙(nylon)膜膜聚偏氟乙稀聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜膜硝酸纤维素硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜膜常用的固相膜固相膜的
3、技术要求孔径：孔径：0.20.20.6 m0.6 m流速：以流速：以ml/cmml/cm2 2/min/min表示表示蛋白质结合力：吸附力很强，以蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cmg/cm2 2表示表示均一性均一性固相NC膜其次节免疫金标记技术其次节免疫金标记技术 免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)(Immunogold labelling techique)主主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处在显微镜下可见黑
4、褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver immunogold silver stainingstaining，IGSSIGSS）。免疫金标记技术胶体金（胶体金（colloidal goldcolloidal gold）的制备一般接）的制备一般接受还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、受还原法，常用的还原剂
5、有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向确定浓度抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向确定浓度的金溶液内加入确定量的还原剂使金离子还的金溶液内加入确定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solutiongold solution）。）。胶体金制备原理 胶体金的制备及特性胶体金粒径胶体金粒径1%1%柠檬酸檬酸钠加入量加入量胶体金特性胶体金特性（nm)nm)（ml)*ml)*呈色呈色lmax(nmlmax(nm)16162.002.00橙色橙色51851824.524.51.501.50橙橙红色色52252241411.001
6、.00红色色52552571.571.50.700.70紫色紫色535535*还原还原100 ml0.01%HAuCl4 100 ml0.01%HAuCl4 所需量所需量胶 体 金（Colloidal Gold）1560 nm优质优质劣质劣质胶体金结合物（Conjugate）第三节膜载体免疫测定的种类与原理第三节膜载体免疫测定的种类与原理斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,(dot immunogold filtration assay,DIGFA)DIGFA)免疫层析试验免疫层析试验（immunochromatography
7、assay,ICAimmunochromatography assay,ICA）斑点斑点ELISAELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-(dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)ELISA)酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot,ELISPOT)(enzyme linked immunospot,ELISPOT)免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)(immunoblotting test,IBT)放射免
8、疫沉淀试验放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)固相微孔膜测定种类l 免疫渗滤测定免疫渗滤测定（IMMUNOFILTRATION ASSAYIMMUNOFILTRATION ASSAY，IFAIFA）l 免疫层析测定免疫层析测定（IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAYIMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY，ICAICA）IFA 和ICAIFA IFA 穿流（穿流（FLOW THROUGHFLOW THROUGH）ICA ICA 横流（横流
9、（LATERAL FLOWLATERAL FLOW）免疫渗滤测定(IFA)AB双抗体夹心法测抗原IFA免疫层析测定ICA样样品品垫垫结结合合物物垫垫NCNC膜膜吸吸水水垫垫ICA 试剂条 双抗体夹心法测抗原ICA间接法测抗体ICA 阳性阳性阴性阴性无效无效ICA 结果视察IFAIFAICAICA试剂形式形式渗渗滤装置及附加装置及附加试剂试剂条条试剂保存保存486486个月个月室温一年室温一年操作步操作步骤35351 1观察察时间3min3min320min320min阳性反阳性反应颜色色浓度度操作操作结束束颜色不色不变颜色逐色逐渐加深加深IFA与ICA的比较优点点不足之不足之处简便，快速便，快
10、速敏感度略低，价格略高（与敏感度略低，价格略高（与ELISAELISA比）比）单份份测定定精密度精密度较差，差，质控困控困难保存期保存期长（优质试剂）稳定性定性较差（普通差（普通试剂）可可测定物范定物范围广（主要广（主要为定性定性试验）不易制不易制备定量、半定量定量、半定量试剂感染性疾病的感染性疾病的诊断断妊娠、排卵的妊娠、排卵的诊断断肿瘤瘤标志志心肌心肌标志志滥用用药物物膜固相免疫测定的特点阳性阴性固相膜固相膜固相固相抗原抗原待测待测抗体抗体金标记抗人金标记抗人IgGIgG抗体抗体人人IgGIgG固相抗人固相抗人IgGIgG抗体抗体快速检测（渗滤法）原理图快速检测（渗滤法）原理图快速检测（渗
11、滤法）原理图快速检测（渗滤法）原理图GIFA技术的发展（间接法测抗体）第一代第一代19881988HIVCHEKHIVCHEK（DuPontDuPont）单点，点，510510分分钟，血清，血清，金金标试剂瓶装瓶装冻干品干品改改进抗原抗原HIV1+2HIV1+2，提高敏，提高敏感度和特异性，感度和特异性，缩短反短反应时间，减少步，减少步骤，样品多品多样化化。第八代第八代INSTANTCHEKHIV1+2INSTANTCHEKHIV1+22 2点（点（测试+控制）控制）金金标试剂：单人份、液体人份、液体样品：品：血清、血血清、血浆、全血、全血、尿尿液液第九第九十二代十二代研制中研制中单一一试剂G
12、IFA技术的发展19901990年年 ABBOTT ABBOTT公司公司 胶体硒标记胶体硒标记ICAICA Unipath Unipath公司公司 CLEARVIEW CLEARVIEW 立明衣原体立明衣原体 彩色胶乳标记彩色胶乳标记ICAICA ROCHE Cardiac Reader ROCHE Cardiac Reader TnT TnT 定量定量 0.13 ng/ml 0.13 ng/ml 合成合成TnTTnT质控点质控点ICA技术的发展IFAIFA肌肌红蛋白蛋白双孔法双孔法SS：测定孔定孔CC：定量：定量质控控 100g/L100g/LIFAIFA微量白蛋白微量白蛋白单孔法孔法TT：
13、测定孔定孔C1C1：定量：定量质控控30mg/L30mg/LC2C2：定量：定量质控控200mg/L200mg/L 结果判定：果判定：（-）30200mg/L200mg/LICAICA甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）参考参考值：30g/L30g/L肝癌肝癌诊断断值：400g/L400g/L结果判定：果判定：（-）30400g/L400g/LSC测测定定线线对对照照线线TC2 C1半定量测定Dot-ELISA 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因被捕获的细胞因子与生
14、物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。的亲和素结合。BCIP/NBT BCIP/NBT 底物孵育后，底物孵育后，PVDF PVDF 孔板出孔板出现现“紫色紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL CTL 公司生产的公司生产的 ELISPOT ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。得出结果。ELISPOT 检测原理l哪些斑点是抗原特异性哪些斑点是抗原特异性 T T 细胞产生的（此斑细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产点具有
15、进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有生的（此斑点没有 T T 细胞探讨价值）细胞探讨价值）l斑点大小的意义斑点大小的意义 l在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸点最大和最小尺寸 l如何从单个细胞基础上分析如何从单个细胞基础上分析 l试验精确度有多高？假如一个细胞产生相像的试验精确度有多高？假如一个细胞产生相像的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？l几次重复试验才能使结果更有意义？几次重复试验才能使结果更有意义？ELISPOT 分析仪解决以下问题ElispotElispot结果推断方法学评价Westernblot原理抗原表位可能被破坏而漏检抗原表位可能被破坏而漏检Westernblot缺点放射免疫沉淀试验原理抗原表位不会破坏抗原表位不会破坏放射免疫沉淀试验