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1、临床免疫学检验技术,学好临床免疫学检验技术，必须掌握“一个核心，三个要素与四个标记”。一个核心： 抗原抗体结合反应(Antigen-antibody interaction)三个要素：抗原、抗体和免疫细胞四个标记：酶标记技术、放射免疫标记技术、荧光标记技术与化学发光标记技术。,概念：抗原抗体结合反应是指抗原抗体的特异性结合反应,体内,杀菌、溶菌、调理、中和毒素免疫病理损伤超敏反应、免疫性疾病等,体外：凝集、沉淀、溶细胞、中和毒素、补体结合等,抗原抗体结合反应,目的掌握: 1.抗原抗体反应原理及特点。 2.带现象、前带、后带、亲合力、 亲和力概念。熟悉: 影响抗原抗体反应的因素。了解: 免疫学检
2、测的类型。,第三节第五节 P15-P20,主要内容：,一、,抗原抗体结合反应的原理,二、,抗原抗体反应的特点,三、,影响抗原抗体反应的因素,四、,免疫学检测的类型,一、抗原抗体结合反应的原理,(一) 基本原理：,特异性（AD-HVR）,可见性（凝集、沉淀、溶血等）,结合力(4种),抗原抗体,（二）抗原抗体结合力,1.静电引力或库仑引力 指带电离子基团（如：NH3+和 COO-） 之间的引力，距离越近引力越大。,2.范德华引力（Van der Waals forces）,分子间（或原子间)相互接近，分子极化产生引力，其作用取决于分子空间构型，如：凹槽与凸起互补，抗原与抗体，酶与底物。能量小于静电
3、引力。,3.氢键结合力（hydrogen bounding force）,指供氢体氢原子与受氢体原子之间的引力“氢键桥梁” ，能量大于范德华引力。,4.疏水作用力（ hydrophobic force ）,指疏水基团间排斥水分子，相互聚集的力。作用力最强，占总结合力的50。,（二）抗原抗体结合力,大小都与两分子间的距离密切相关只有两分子表面密切接触时，才能产生足够的力使其结合抗原与抗体之间高度的空间互补结构恰好为这些结合力的发挥提供了条件,结合力的大小,表示,一个抗体结合点与一个抗原表位间的结合强度。 “（single point single point ）” 亲和力用平衡常数表示：K=K1
4、 / K2,亲和力（affinity）：,即：结合常数/解离常数 K值越大，亲和力越高， 与抗原的结合越牢固,亲合力（avidity）,指整个抗体分子与抗原表位之间结合的强度 “all points-all points”,与抗体的结合 价直接相关。亲合力高，与抗原结合牢固不易解离。,(三)抗原抗体反应的特点,1、特异性（specificity）,两种不同的抗原分子具有相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应,抗原抗体交叉反应示意图,交叉反应（cross reactions）,2、比例性 (proportionality),指抗原抗体的量比关系，即只有当抗原抗体的浓度比例适当时，
5、才出现可见反应。,以沉淀反应为例（Ab量固定,Ag量递增）,图,Question：等价带前带后带,抗原抗体反应比例性示意图,Why?,抗原多价，抗体双价,二者比例合适,Ag/Ab过剩,网格学说,网格学说（图）,抗体的两个Fab段分别结合两个Ag分子，相互交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物，（可见）。,二者比例合适：,Ab/Ag过剩过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物（不可见）。,网格学说（图）,切记！,确定 的浓度非常重要，即在实验中需对Ag/Ab进行适当的 ，调整二者的比例，产生可见反应。一般原则：固定 含量（ Ag/Ab ）的浓度，稀释 含量的 (Ab / Ag)
6、。一般可溶性Ag稀释 ，颗粒性Ag，稀释 。,Ag/Ab,稀释,低,高,Ag,Ab,3、可逆性（reversibility）或表面性,4、阶段性,特异性结合,两个阶段,可见反应阶段,数秒数分钟， 肉眼不可见,数分数小时肉眼可见,（四）影响抗原抗体反应的因素,1、Ag/Ab自身因素（1）Ag 理化性状：颗粒性Ag、可溶性Ag、 R型细菌Ag等出现不 同的Ag-Ab reaction. AD的种类与数目：单价Ag,（2）Ab,R型Ab ：等价带宽， 易出现可见反应。H型Ab ：等价带窄，易出现前带或后带现象McAb:不宜用于凝集和沉淀反应。,浓度：相对Ag而言，比例要和适，故实验前 需滴定，以求最
7、适Ag与Ab比例。,特异性与亲合力：关键因素，选择特异性 与亲合力高的Ab。,2、环境因素,（1）电解质 作用：中和胶体表面电荷，破坏水化层， 使Ag-Ab聚集。 常用：8.5g/L NaCl溶液，缓冲液、Ca2+、 Mg2+等。 注意：盐析（salting）即电解质浓度过高 引起的非特异性蛋白质沉淀。,（2）酸碱度,Ag、Ab多为蛋白质，具两性电离特性，有其故有的PI , pH过高或过低均可影响Ag、Ab反应。一般：pH69为宜，补体参与时pH7.27.4。注意：自凝现象-即pH达到或接近颗粒性抗原的PI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。,（3）温度影响反应速度,一般：1540 为宜，最适
8、温度：37, 过高（56）: Ag-Ab解离， Ag、Ab变性， 补体失活。冷凝集实验：4 凝集，20解离。,（四）其他 振荡、搅拌等可加速反应,表,抗原抗体反应的基本类 型 表反应类型 实验技术 检测方法 敏感度,沉淀反应 液相沉淀试验 观察沉淀、检测浊度 +，+ 琼脂凝胶扩散 观察扫描沉淀线或环 + 凝胶电泳技术 或峰或弧 +,补体参与反应 补体溶血试验 以裸眼或光电比色仪 + 补体结合试验 观察测定溶血现象 +,免疫标记技术 荧光免疫技术 检测荧光现象 + 放射免疫技术 检测放射性 + 酶标免疫技术 检测酶底物显色 + 发光免疫技术 测定发光强度 + 生物素-亲合素技术 结合其它标记技术
9、 + 金标免疫技术 检测金颗粒沉淀 +,凝集反应 直接凝集试验 用裸眼、放大镜或显 + 间接凝集试验 微镜观察红细胞或胶 + 凝集抑制试验 乳等颗粒和各种凝集 + 协同凝集试验 现象 + 抗球蛋白试验 +,中和反应 病毒中和试验 病毒感染性丧失 + 毒素中和试验 外毒素毒性丢失 +,概念：抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 原理：抗原抗体特异性结合，紧密接触，产生四种结合力：静电引力、范德华引力、氢键和疏水作用力。 特点：特异性、可逆性、比例性和阶段性。 影响因素：包括反应物的自身因素和环境因素。 免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应，免疫学技术有凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应、中和反应和标记免疫反应五种类型。 重要名词：亲和力、亲合力、等价带、前带、后带等。,小结,