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1、实验三：DNA提取及PCR反应蒋建伟第一部分：第一部分：DNA提取提取一、一、DNA提取的基本步骤提取的基本步骤三、三、DNA提取常见问题与对策提取常见问题与对策二、二、DNA提取注意事项提取注意事项一、DNA提取的基本步骤 I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放 III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中DNA提取（一）样品准备：（一）样品准备：1 1、组织：、组织：3g组组织织，用用8层层纱纱布布包包好好，再再包包多多
2、层层牛牛皮皮纸纸，浸浸入入液液氮氮，取取出出，用用木木锤敲碎。锤敲碎。碎组织放入搪瓷钵中，加少量液氮，碾磨至粉末状。碎组织放入搪瓷钵中，加少量液氮，碾磨至粉末状。在在50ml离离心心管管中中，加加10mlDNA提提取取液液，用用玻玻棒棒边边搅搅动动液液体体，边边加加入入组织粉末，组织粉末，37混匀。混匀。2、组组织织，3g，-70保保存存，临临用用时时用用玻玻璃璃匀匀浆浆器器，用用DNA提提取取液液 将将组组织织磨成匀浆。磨成匀浆。注：DNA提取液提取液 见见 p-8 或或 p-11,下同。下同。（一）样品准备（一）样品准备3、培养细胞、培养细胞消化收集细胞，消化收集细胞，PBS洗洗3次，加次
3、，加10mlDNA提取液提取液，混匀。，混匀。4、血液、血液取血液离心，取淡黄色白细胞层，加取血液离心，取淡黄色白细胞层，加NS，离心。，离心。或者加或者加2O，离心，收集白细胞。，离心，收集白细胞。加加10mlDNA提取液提取液，37mix。（一）样品准备（一）样品准备（二）提（二）提DNA酚抽提法：酚抽提法：加加RNase，371h，加蛋白酶加蛋白酶K，50，3h；或或3712h,不时不时mix加等体积酚，充分加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。，小心吸取上层粘稠水相。加等体积酚，充分加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相
4、。，小心吸取上层粘稠水相。氯氯仿仿-异异戊戊醇醇(24:1)抽抽提提1次次。9000rpm，3min，小小心心吸吸取取上上层层粘粘稠稠水相。水相。移到移到50ml烧杯中，加烧杯中，加倍体积冷无水乙醇，用玻棒钩出倍体积冷无水乙醇，用玻棒钩出DNA。TE溶解。溶解。2 2、异丙醇沉淀法：、异丙醇沉淀法：原理：原理：用用2倍倍体体积积异异丙丙醇醇沉沉淀淀DNA溶溶液液，DNA沉沉淀淀是是丝丝状状，而而RNA溶溶于于异异丙丙醇醇中中，可可除去除去RNA。细胞，细胞，PBS洗洗2次。次。3mlTEN重悬，加重悬，加DNA提取液提取液，蛋白酶，蛋白酶K，5014h加等体积饱和酚，混匀，加等体积饱和酚，混匀
5、，9000rpm3min，小心吸取上层粘稠水相。，小心吸取上层粘稠水相。氯仿氯仿-异戊醇异戊醇(24:1)抽提抽提1次，次，9000rpm3min，小心吸取上层粘稠水相。，小心吸取上层粘稠水相。加加2倍体积的异丙醇，用玻棒钩出倍体积的异丙醇，用玻棒钩出DNA。TE溶解。溶解。（二）提（二）提DNAq SDS法法-提取提取DNASDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（5565）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及
6、多多糖糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。组份组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液小小 结结q SDSSDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例）动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组DNASDS法qCTAB法法CT
7、AB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基十六烷基三甲基溴化铵溴化铵），），是一种阳离子去污剂，可是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（）是可溶的，可通过有机溶剂抽提是可溶的，可通过有机溶剂抽提，去除，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。蛋白、多糖、酚类等杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，
8、且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。举举 例例qCTAB提取缓冲液提取缓冲液 的经典配方的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加）使用前加入入Tris-HCl（）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液
9、相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA CTAB法qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶聚乙烯吡咯烷酮）是酚
10、的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA CTAB法qCTAB法流程图：法流程图：植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液二、二、DNA提取注意事项提取注意事项1.材料准备最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复低温保存的样品材料不要反复冻融冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）
11、时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少，提取前先富集含量较少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取注意事项注意事项2.细胞裂解适量。过多会影响裂解，导致适量。过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的针对不同材料，选择适当的裂解预处理裂解预处理 方式：方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠
12、高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取注意事项注意事项3.核酸分离、纯化：采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。法。基因组基因组DNADNA的提取的提取注意事项注意事项q蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）异硫氰酸胍等）高盐洗涤
13、高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。高盐可溶解多糖。用用 多糖水解酶多糖水解酶 将多糖降解。将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的在提取缓冲液中加一定量的氯苯氯苯 (1/2,(1/2,v/vv/v)，氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20%PEG200l 20%PEG
14、8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl)，冰浴冰浴20min20min。注意事项注意事项q多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入在抽提液中加入 防止酚类氧化防止酚类氧化 的试剂：的试剂：-巯基乙醇巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合q盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤注意事项注意事项4.核酸沉淀、溶解当沉淀
15、时间有限时，用当沉淀时间有限时，用预冷的预冷的 乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。更充分。沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（，3M），），有利于充分沉淀。有利于充分沉淀。沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等。的乙醇洗涤，以除去盐离子等。晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。缓冲液溶解。TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase。pH值为值为，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解。基因组基因组DNADNA的提取的
16、提取注意事项注意事项 三、DNA提取常见问题与对策1.DNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有在溶解前，有酒精残留，酒精抑酒精残留，酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应3.DNA中残留中残留有金属有金属离子离子1.重新纯化重新纯化DNA，去除蛋去除蛋白、多糖、多酚等杂质白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）（具体方法见前）2.重新沉淀重新沉淀DNA，让酒精让酒精充分挥发充分挥发3.增加增加70乙醇洗涤的次乙醇洗涤的次数（数（2-3次）次）q问题一：问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应反应。原原因因对对策策DNA提取常见
17、问题与对策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融。免反复冻融。2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。前加入裂解缓冲液。3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNA时，可增加裂解液中时，可增加裂解液中螯合剂螯合剂的含量。的含量。
18、4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。温灭菌。6.6.将将DNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。反复冻融。q问题二：问题二：DNA降解降解。对对策策原原因因DNA提取常见问题与对策1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料。料。2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前
19、先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。或机械方式破壁。3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PK的用量）。的用量）。4.4.低温沉淀，延长沉淀时间。低温沉淀，延长沉淀时间。5.5.加辅助物，促进沉淀。加辅助物，促进沉淀。6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。液吸出，勿倾倒。DNA提取常见问题与对策q问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。对对策策原原因因 第二节第二节 PCR反应反应 一、一、PCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程 二、PCR标准反应体系：三、三、PC
20、R的反应条件（反应参数）的反应条件（反应参数）四、PCR常见问题与对策 五、PCR衍生技术（略）多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)Kary B.MullisKary B.MullisPCR是由美国科学家是由美国科学家Mullis提出的一种提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNA体内复制的体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。一、一、PCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程DNA的体外复制包括的体外复制包括3个步骤：个步骤：变性（变性（denaturation）
21、:94 C 95 C 退火（退火（annealing）:40 C 70 C 延伸（延伸（extension）:72 C 3个步骤作为个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。产物量以指数形式增长。Mullis的的PCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)thermus aquaticus)酶酶活活性性(%)温度温度温度温度()40 50 60
22、70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸 PCR的指数扩增（的指数扩增（2n）引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5 5 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火二、PCR标准反应体系：DNA模板模板 引物引物 反应缓冲液反
23、应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶耐热聚合酶1 模板模板单、双链单、双链DNA均可。注意模板的均可。注意模板的完整性，完整性，模板降解会导致模板降解会导致PCR扩增无产物。扩增无产物。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白结合蛋白类。类。蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应。反应。RNA作为模板时，须先将作为模板时，须先将RNA逆转录为逆转录为cDNA，再以再以 cDNA作作为为扩增的模板。扩增的模板。DNA模板一般模板一般100ng/100 L。模板浓度过高会导致反应的非模板浓度过高会导致反应的非
24、特异性增加。特异性增加。2、引、引 物物（Primers)引物决定引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。扩增产物的特异性和长度。是化学合成的寡核苷酸，是化学合成的寡核苷酸，能与模板特异地结合，能与模板特异地结合，引物决定引物决定PCR产物的特异性和长度。产物的特异性和长度。引物设计的原则（一）引物设计的原则（一）引物长度：引物长度：15-30bp，常用为，常用为20mer左右左右.引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过，否则最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（聚合酶的最适温度（74），不能保证），不能保证PCR扩增产物的特异性。扩增产物
25、的特异性。引物扩增跨度引物扩增跨度：以以500bp为宜，特定条件下可扩增长至为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。的片段。引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜。引物退火温度计算：为宜。引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）。）。Tm在在55-65 最好。最好。G+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物的解链温度：两个引物之间的引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在值差异最好在
26、5之内。之内。引物设计的原则（二）引物设计的原则（二）避免引物内部出现二级结构避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，避免两条引物间互补，特别是特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带。产生非特异性的扩增条带。引物引物 3端的碱基要求严格配对端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。失败。引物中有或能加上合适的酶切位点引物中有或能加上合适的酶切位点引物引物3端为关键碱基；端为关键碱基；5端无严格限制，端无严格限制，引物的引物的5端可
27、被修饰（引入酶端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）。切位点、引入突变位点、生物素等标记）。引物设计的原则（三）引物设计的原则（三）引物的特异性：引物的特异性：序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。与非扩增区无同源序列。引物量：引物量：引物浓度：，引物浓度：，浓度过高容易生成引物二聚体，过低则扩增产物减少。浓度过高容易生成引物二聚体，过低则扩增产物减少。其他：其他：避免反复冻融。避免反复冻融。RT-PCR 引物设计特别注意：跨越两个外显子。引物设计特别注意：跨越两个外显子。3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是是dATP、dCTP、dGTP和和dTTP4种脱
28、氧核苷三磷酸的混合物种脱氧核苷三磷酸的混合物。dNTP呈颗粒状，酸性，使用时应配成高浓度后，以呈颗粒状，酸性，使用时应配成高浓度后，以1M Tris-HCl的缓的缓冲液将其冲液将其pH调节到调节到，小量分装，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。降解。在在PCR反应中，反应中，dNTP应为应为20200umol/L，尤其是注意尤其是注意4种种dNTP的的浓度要相等（等摩尔配制浓度要相等（等摩尔配制），），如其中任何一种浓度不同于其它几种时如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。（偏高或偏低），就会引起错配。浓度升高增加非特异性扩增；浓
29、度升高增加非特异性扩增；浓度浓度过低又会降低过低又会降低PCR产物的产量。产物的产量。dNTP 能与能与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度降低。4、DNA聚合酶聚合酶l从一种生活在热泉（从一种生活在热泉（8090）中的水栖噬热菌（）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。中提取，有很高的耐热稳定性。lTaq酶的作用：在模板指导下，以酶的作用：在模板指导下，以dNTP为原料，在引物为原料，在引物3-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成末端加上脱氧单核苷酸，形成3,5-磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNA链沿链沿53方向延伸，催化方向延
30、伸，催化DNA合成。合成。l最适酶量：最适酶量：0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。TaqDNA聚合酶复制的保真性：聚合酶复制的保真性：TaqDNA聚合酶无聚合酶无35外切酶活性外切酶活性，因而无校正功能，在复因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。制新链的过程中会发生碱基错配。TaqDNA聚合酶在每聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。，故扩增的片段越长，错配的机率越高。PfuDN
31、Apolymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率基错配率210倍。倍。5 5、镁离子浓度、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高苷酸和提高Taq酶的活性有直接影响。酶的活性有直接影响。当当dNTP浓度为浓度为200umol/L时，时，MgCl2的浓度为的浓度为1.5mmol/L较宜。较宜。6、其它反应因素、其它反应因素pH：调节至酶反应所需的最适：调节至酶反应所需的最适pH（左右）左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交
32、盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交小结：反应体系对小结：反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响DNA模板模板纯度纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCRPCR反应反应完整性完整性 模板降解会导致模板降解会导致PCRPCR扩增无产物扩增无产物浓度浓度 加量过多导致非特异性扩增增加加量过多导致非特异性扩增增加特异性特异性 长度适当长度适当、避免二级结构和二聚体避免二级结构和二聚体完整性完整性 避免反复冻融避免反复冻融浓度浓度 应适当应适当,过高导致非特异性增加过高导致非特异性增加,过低则过低则引引 物物扩增产物太少扩增产物太少小结：反应体系对小结
33、：反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响反应反应BufferBuffer pH值值,盐离子浓度盐离子浓度稳定剂稳定剂,增强剂增强剂Mg 2浓度浓度过高非特异性严重过高非特异性严重过低无扩增产物过低无扩增产物dNTP MixturedNTP Mixture浓度适当浓度适当避免反复冻融避免反复冻融ddH2OpH值适当值适当避免污染避免污染三、三、PCR的反应条件的反应条件（变性、退火、延伸）反应温度（变性、退火、延伸）反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）反应时间循环次数（循环次数（PCR效率及产物量）效率及产物量）温度的设置温度的设置：设置变性设置变性-退火退火-延伸三个温
34、度点延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，标准反应中采用三温度点法，变性温度：变性温度：94 94 97 97 退火温度：低于引物退火温度：低于引物Tm 5 Tm 5 左右左右 温度过高：降低扩增效率；温度过高：降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。温度过低：增加非特异性扩增。延伸温度：延伸温度：7272度，此时度，此时TaqTaq酶具有较高的酶。酶具有较高的酶。对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，时）可采用二温度点法，将退将退火与延伸温度合二为一，一般采用火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，变性，65左右退火与延伸。左右退火与延伸。变性
35、温度与时间：变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。失败的最主要原因。一般一般9394,1min足以使模板足以使模板DNA变性变性若低于若低于93则需延长时间则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致产物完全变性，就会导致PCR失败失败 退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060，
36、可使引物和模板发生结合。由于模板，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。度。对于对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引物，的引物，55为选择最适退火温度的起点较为选择最适退火温度的起点较为理想。为理想。引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：通过以下公式帮助选择合适的温度
37、：Tm值（解链温度）值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）复性温度复性温度=Tm值值-（510）在在Tm值允许范围内，值允许范围内，选择较高的复性温度选择较高的复性温度 可大大减少引物和模可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。反应的特异性。复性时间一般为复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全，足以使引物与模板之间完全结合结合 延伸温度与时间：延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：高于高于90时，时，DNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行 7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 70 60核
38、苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 延伸温度与时间：延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在7075之间之间常用温度为常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1 Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间片段，延伸时间1 min（足够）。（足够）。34 kb的靶序列需的靶序列需34 min扩增扩增10 Kb需延伸至需延伸至15 min。延伸进间过长会导致非特异性扩增。对低浓度模板的扩增，延伸进间过长会导致非特异性扩增。对低浓度模
39、板的扩增，延伸时间要稍长些。延伸时间要稍长些。3 3、循环次数、循环次数 重复次数一般设为重复次数一般设为2535个循环个循环扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应：理论上，理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增增长形式在扩增25或或25个循环以后便放慢直至个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。循环次数的增加而呈指数增长。n指数增长期n平台期循环数#理论值 实际值Log 产物DNAPCR过程的实时监测平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越平台出现得迟早
40、与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。多，平台出现得越早。平台效应产生的因素：平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等片段间的竞争等使用使用PCR增强剂增强剂 甲甲酰酰胺胺，DMSO，甘甘油油，甜甜菜菜碱碱等等都都可可充充当当PCR的的增增强强剂剂，其其可可能能的的机机理理是是降降低低熔熔解解温温度度，从从而而有有助助于于引引物物退退火火并并辅辅助助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适当增强剂浓度要适当 四、PCR常见问题
41、 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性PCR常见问题之一无扩增产物1.1.模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4.4.反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短原原因因对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或或加大模板的用量加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级
42、结构）或者换一管新引物管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；PCR常见问题之二 非特异性扩增 现现象象：PCRPCR扩扩增增后后出出现现的的条条带带与与预预计计的的大大小小不不一一致致，或或大大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCR常见问题之二1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多原
43、原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增PCR常见问题之三 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M12PCR常见问题之三1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+
44、浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多原原因因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和和镁离子镁离子的的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾PCR常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶
45、序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除除酶酶及及不不能能耐耐高高温温的的物物质质外外，所所有有试试剂剂或或器器材材均均应应高高压压消消毒毒。所所用用离离心心管管及加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。五、以五、以PCR为基础的相关技术为基础的相关技术逆转录逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)定量定量PCR(quantitativePCR)多重多重PCR(multiplexPCR)免疫免疫PCR差异显示差异显示PCR(differentialdisplayPCR,DD-PCR)PCR诱导定点突变诱导定点突变原位原位PCR(insituPCR)