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1、哺乳动物哺乳动物DNA的快速分离与的快速分离与PCR扩增扩增1111一、一、 实验目的实验目的1、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会 并掌握从哺乳动物组织中并掌握从哺乳动物组织中提取基因组总提取基因组总DNA的原理的原理 与技术，为与技术，为PCR分析，分析，RFLP分析，基因文库的构分析，基因文库的构 建，基因检测等研究打下基础；建，基因检测等研究打下基础；6 6、将上清液转移到一个新离心管中，加、将上清液转移到一个新离心管中，加0.6 mL 0.6 mL 异丙醇异丙醇。 充分混匀，充分混匀， 12000 g 12000 g 离心离心
2、5 min 5 min （4 4 ）。）。7 7、去掉上清，加入、去掉上清，加入0.6 mL 0.6 mL 70% 70% 乙醇乙醇。颠倒离心管数次，。颠倒离心管数次， 12000 g 12000 g 离心离心 1 min1 min（4 4）。）。8 8、去掉上清，空气中干燥、去掉上清，空气中干燥 DNADNA沉淀沉淀 15 min15 min。9 9、将、将DNADNA沉淀沉淀溶解溶解于于 100 L TE 100 L TE 或水中。或水中。1010、浓度和纯度测定：、浓度和纯度测定： OD OD260260/OD/OD280280= 1.8-2.0= 1.8-2.0； 1 OD1 OD26
3、0260= 50 = 50 g/ mLg/ mL1、设计、设计PCR反应程序反应程序 9494预变性预变性2 min2 min后开始以下循环后开始以下循环 94 30 sec94 30 sec 55 30 sec 25 cycles 55 30 sec 25 cycles 72 30 sec 72 30 sec 72 5 min 72 5 min； 4 4 冷却恒定。冷却恒定。（二）、（二）、PCR扩增基因片断扩增基因片断2 2、在、在0.5ml0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分：薄壁管中，依次加入以下各成分： ddHddH2 2O:O: 18.0 18.0 L L 10 10buffer
4、: 2.5 buffer: 2.5 L L dNTPs(2.5 dNTPs(2.5 mMmM) ) 1.0 L L Forward primer (10 Forward primer (10 M M) ) : 1.0 : 1.0 L L Reverse primer (10 Reverse primer (10 M M) ) : 1.0 : 1.0 L L Taq DNA Taq DNA 酶酶(5U/(5U/ L L) ) : 0.5 : 0.5 L L Template DNA(20ng/ Template DNA(20ng/ L L): 1.0 ): 1.0 L L 总体积总体积 25 2
5、5 L L3 3、混匀后，离心、混匀后，离心2-3 sec2-3 sec，将，将PCRPCR薄壁管放入薄壁管放入PCRPCR仪的仪的 样品槽中，选择预先设定的程序，按样品槽中，选择预先设定的程序，按STARTSTART键启动键启动 PCRPCR仪。仪。4 4、采用、采用1.21.2琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析PCRPCR产物的量、引产物的量、引 物扩增的特异性。物扩增的特异性。五、实验结果与分析五、实验结果与分析 1 1、提取的猪肝、提取的猪肝DNADNA进行电泳后，采用凝胶成像系统进行电泳后，采用凝胶成像系统 进行进行拍照拍照并对电泳图谱进行适当的并对电泳图谱进行适当的分析分析。 2 2、对、对PCRPCR扩增的基因进行电泳后的图谱扩增的基因进行电泳后的图谱拍照拍照并进行并进行 合理的合理的分析分析。六、思考题：六、思考题：1 1、为了获得较为完整的基因组、为了获得较为完整的基因组DNADNA，在实验应注意，在实验应注意 什么问题？什么问题？ 2 2、简述、简述PCRPCR基本原理；基本原理；3 3、进行一次成功的、进行一次成功的PCRPCR反应应注意哪些问题？反应应注意哪些问题？基因组DNA电泳图RNA提取电泳图PCR结果图18 结束语结束语