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1、第五章第五章 外源基因的表达外源基因的表达（the expression of foreign gene)第一节第一节 外源基因的表达体系外源基因的表达体系原核生物转录过程RNA聚合酶亚基发现启动子序列与-35区结合 进一步与-10区结合 解链（17bp)使模板暴露 因子识别并起始启动位点 pppA/pppG 因子解离，NusA与RNA聚合酶结合（放松）RNA聚合酶向前滑动，继续解12bp链 终止（依赖因子、不依赖 因子）一、基因表达的机制外源基因的起始转录：可调控的启动子外源基因的起始转录：可调控的启动子mRNA的延伸与稳定性的延伸与稳定性外源基因外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译（起始密
2、码子、（起始密码子、SD序列、序列、SD序列与起始序列与起始密码子之间的距离为密码子之间的距离为39个碱基）个碱基）表达蛋白在细胞中的稳定表达蛋白在细胞中的稳定目的基因沉默目的基因沉默(位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默、转录后水平的基因沉默）默、转录后水平的基因沉默）二、外源基因表达系统二、外源基因表达系统概念：概念：目的基因与目的基因与表达载体表达载体重组后，导入合适的重组后，导入合适的受体细受体细胞胞，并在其中有效表达，产生目的基因产物。，并在其中有效表达，产生目的基因产物。原核生物基因表达系统原核生物基因表达系统(大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系
3、统、链霉菌大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统和蓝藻表达系统）表达系统和蓝藻表达系统）真核生物基因表达系统真核生物基因表达系统原核基因表达系统原核基因表达系统生长快，可通过发酵获得大量基因表达产物生长快，可通过发酵获得大量基因表达产物基因组结构简单，便于基因操作与分析基因组结构简单，便于基因操作与分析多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体相应的表达载体生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的
4、空间构象定的空间构象内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性的不稳定性大肠杆菌基因表达载体复制子复制子启动子和终止子启动子和终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子（简并密码子的选择）密码子（简并密码子的选择）选择标记（抗生素抗性基因）选择标记（抗生素抗性基因）三、制约目的基因表达的因素1、外源基因是否插入在正确的阅读框架、外源基因是否插入在正确的阅读框架2、目的基因的有效转录（如启动子的作用）、目的基因的有效转录（如启动子的作用）3、mRNA的有效翻译（如的有效翻译（如SD序列等作用）序列等作用）4、转录后，翻译后的适当的修饰和加工过
5、程、转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程 四、阅读框架四、阅读框架 在在DNA链上链上,由蛋白质合成的起始密码开始由蛋白质合成的起始密码开始,到终止密到终止密码子为止的一个连续编码序列码子为止的一个连续编码序列,叫做一个开放阅读框叫做一个开放阅读框架（架（open reading frame,ORF）五、启动子与转录的影响五、启动子与转录的影响 1、在原核细胞的转录过程中，决定外源基因表达的、在原核细胞的转录过程中，决定外源基因表达的关键因素是外源基因必须在载体关键因素是外源基因必须在载体DNA的启动子控制的启动子控制之下，而且启动子又能被宿主细胞中的之下，而且启动子又能被宿主细胞中的RNA聚
6、合酶聚合酶有效识别。有效识别。选择填空2、启动子、启动子DNA序列中两个高度保守区域是必序列中两个高度保守区域是必须的（须的（-10区与区与-35区），没有这两个高度保守区），没有这两个高度保守区域，就没有启动作用。但是启动子区域，就没有启动作用。但是启动子DNA序序列中保守性较差部分和两个保守区之间的核列中保守性较差部分和两个保守区之间的核苷酸数量也影响启动子的功能苷酸数量也影响启动子的功能。LacUv5 trp启动子启动子 trp-lacUv5启动子启动子（1）原原核核生生物物：大大约约在在RNA合合成成起起点点之之前前的的10bp和和35bp处处，由由两两个个由由6个个核核苷苷酸酸组组成
7、成的的共共有序列有序列 -10区区：TATAAT（the pribnow box）-35区区：TTGACA（2）真核生物真核生物 -30区：区：TATA盒：盒：TATAAAA -80区：区：CAAT盒：盒：GGTCAATCT 六、翻译过程对表达的影响 1、SD序序列列与与rRNA的的16s亚亚基基3末末端端序序列列之之间间的互补程度，是影响翻译效率的主要因素。的互补程度，是影响翻译效率的主要因素。2、起起始始密密码码AUG与与SD序序列列之之间间的的距距离离以以及及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。序列的核苷酸组成也影响翻译能力。3、起起始始密密码码之之后后的的一一个个核核苷苷酸酸对对mRN
8、A与与核核糖体的结合也有影响。糖体的结合也有影响。4、基因末端的转录终止区的影响、基因末端的转录终止区的影响 第二节第二节 外源基因在原核细胞外源基因在原核细胞 中的表达中的表达 一、基因工程的表达系统一、基因工程的表达系统 1、克隆原核基因在原核细胞中表达、克隆原核基因在原核细胞中表达2、克隆真核基因在原核细胞中表达、克隆真核基因在原核细胞中表达3、克隆原核基因在真核细胞中表达、克隆原核基因在真核细胞中表达4、克隆真核基因在真核细胞中表达、克隆真核基因在真核细胞中表达原核表达系统：原核表达系统：大肠杆菌系统大肠杆菌系统枯草杆菌系统枯草杆菌系统 真核表达系统：真核表达系统：低等真核细胞（酵母）
9、系统低等真核细胞（酵母）系统哺乳动物细胞系统哺乳动物细胞系统昆虫细胞系统昆虫细胞系统 真核基因在原核细胞中表达的困难1、细菌、细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。聚合酶不能识别真核基因的启动子。2、从从真真核核基基因因转转录录的的mRNA缺缺乏乏SD序序列列，不不能能结结合合到核糖体蛋白上。到核糖体蛋白上。3、真真核核基基因因一一般般含含有有内内含含子子，而而原原核核细细胞胞缺缺乏乏真真核核细细胞胞转转录录后后加加工工系系统统，mRNA中中的的内内含含子子不不能能切切除除，成熟的成熟的mRNA不能形成，不能表达真核蛋白质。不能形成，不能表达真核蛋白质。4、表达的真核蛋白质在原核细胞中不稳
10、定，容易被、表达的真核蛋白质在原核细胞中不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏细菌蛋白酶破坏 2 起始密码子的正确选读起始密码子的正确选读 噬菌体蛋白噬菌体蛋白A：5mRNA GUGAGUAUAAGAGGACAUAUGCCU 3 rRNA 5 ACCUCCUA 3 Q噬菌体复制酶：噬菌体复制酶：5 mRNA UUACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCU3 rRNA 5 ACCUCCUA 3二、原核系统高效表达外源真核基因 的措施 1、将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和、将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD 序列的下游序列的下游2、从真核细胞中分离、从真核细胞中分离mRNA并反转录成并反转录
11、成cDNA3、将真核基因插在几个原核密码之后，通过翻译，通过翻译、将真核基因插在几个原核密码之后，通过翻译，通过翻译得到原核多肽和真核基因产物连在一起的融合蛋白。得到原核多肽和真核基因产物连在一起的融合蛋白。牛的凝血因子牛的凝血因子Xa能识别特异的能识别特异的4肽顺序：肽顺序：Ile（异亮）（异亮）-Glu（谷）（谷）-Gly（甘）（甘）-Ary（精）（精）原核多肽原核多肽-Ile-Glu-Gly-Arg-真核蛋白。用真核蛋白。用Xa水解，分离出真核水解，分离出真核蛋白蛋白 4、减轻宿主细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平 将细胞的生长和外源基因的表达分开成为将细胞的生长和外源基因的表达分开
12、成为两个阶段，以便减低宿主细胞的代谢负荷两个阶段，以便减低宿主细胞的代谢负荷 三、基因表达产物的检测与分离纯化三、基因表达产物的检测与分离纯化1、基因表达产物的检测基因表达产物的检测1.1 外源基因转录产物的检测外源基因转录产物的检测 Northern印迹杂交、印迹杂交、RT PCR1.2 报告基因的酶法检测报告基因的酶法检测 氯霉素乙酰转移酶基因氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)葡萄葡萄糖苷酸酶基因等糖苷酸酶基因等(GUS)1.3 表达产物生物学活性检测表达产物生物学活性检测2、基因表达产物的分离纯化基因表达产物的分离纯化细胞破碎细胞破碎 离心离心 沉淀法、超滤浓沉淀法、超滤浓缩法分离特异表达蛋
13、白缩法分离特异表达蛋白 进一步分离柱进一步分离柱层析层析 聚丙烯凝胶电泳聚丙烯凝胶电泳mRNA差异差异显显示技示技术术及其及其应应用用一、一、mRNA差别显示技术概述差别显示技术概述n高等生物大约有高等生物大约有3 3万万5 5万个基因万个基因n在任一细胞表达的基因约占总数的在任一细胞表达的基因约占总数的15%15%n哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状态下表达，决定了整个生命过程。态下表达，决定了整个生命过程。n比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表达的差异，是克隆特异表达基因的方法。达的差异，是克隆特异表
14、达基因的方法。一、一、mRNA差别显示技术概述差别显示技术概述n1992年年nLiang、PardeenmRNA差异差异显显示技示技术术n（differential display reverse transcripion PCR，DDRTPCR）n动动物、人物、人类类的癌症、心的癌症、心脏脏病、糖尿病病、糖尿病n植物胚胎植物胚胎发发育、无融合生殖、植物抗逆与抗病性育、无融合生殖、植物抗逆与抗病性二、二、DDRT技技术术的原理的原理（一）（一）锚锚定定PCRn锚锚定定PCR（anchored PCR）是是PCR技技术术的的一一种种改改进进，一一般般的的PCR实实验验中中需需要要知知道道目目的的
15、基基因因两两端端的的序序列，而列，而锚锚定定PCR技技术术不需要。不需要。n所所谓谓的的“锚锚定定”就就是是指指一一端端已已经经定定死死了了，另另一一端端通通过过人人工工合合成成引引物物来来定定，这这就就为为许许多多我我们们对对不不清清楚楚其其5端端区区域域或或是是3端端区区域域的的RNA的的分分析析找找到到了了一一条条良良好好的途径。的途径。（二）（二）DDRT技技术术路路线线 提取提取B组织组织RNA提取提取A组织组织RNA锚定引物（锚定引物（GTGT1515A,GTA,GT1515G,GTG,GT1515C C）反转录反转录锚定引物（锚定引物（GTGT1515A,GTA,GT1515G,
16、GTG,GT1515C C）反转录反转录总总RNA完整性鉴定完整性鉴定总总RNA完整性鉴定完整性鉴定获得获得cDNA第一链第一链获得获得cDNA第一链第一链随机引物扩增获得随机引物扩增获得cDNA第二链第二链随机引物扩增获得随机引物扩增获得cDNA第二链第二链采用随即引物和采用随即引物和锚锚定引物定引物进进行行PCR扩扩增增采用随即引物和锚定引物采用随即引物和锚定引物进行进行PCR扩增扩增扩增产物进行凝胶电泳分析扩增产物进行凝胶电泳分析处理 对照将差异条带切出并进行回收将差异条带切出并进行回收重新用相同的重新用相同的锚锚定引物和随即引物定引物和随即引物进进行行PCR扩扩增增Northern杂杂
17、交，交，Southern杂杂交确定差异条交确定差异条带带的真的真实实性性克隆进入质粒载体克隆进入质粒载体测序、进入测序、进入GeneBank序列分析序列分析三、三、mRNA差差别显别显示技示技术术的的优优缺点缺点n1、优点、优点 具有具有简简便、灵敏、便、灵敏、RNA用量少、效率高用量少、效率高 可同可同时时比比较较多种多种给给定生理状定生理状态态或不同或不同发发育育阶阶段的段的 细细胞内胞内mRNAn2、缺点、缺点 1）所得特异性）所得特异性cDNA片段假阳性的比例高，片段假阳性的比例高，75%原因：原因：总总RNA有有DNA污污染染 凝胶中有重叠凝胶中有重叠带带 特异特异cDNA片段太短，
18、得不到片段太短，得不到杂杂交信号交信号三、三、mRNA差差别显别显示技示技术术的的优优缺点缺点n2、缺点、缺点 2）cDNA产产物的物的质质量往往量往往较较低，在凝胶上低，在凝胶上 呈呈现现smear状状态态 3）得到的特异性的）得到的特异性的cDNA 片段非翻片段非翻译译序列序列 利用利用GeneBank进进行数据分析不利行数据分析不利四、四、mRNA差差别显别显示技示技术术的的应应用用n1、研究植物不同分化、研究植物不同分化发发育育阶阶段的基因表达差异段的基因表达差异n2、基因的、基因的鉴鉴定与克隆定与克隆n3、研究激素、研究激素对对植物植物发发育的影响育的影响n4、植物抗逆性机理的研究、
19、植物抗逆性机理的研究n5、在、在营营养学中的养学中的应应用用n6、在、在肿肿瘤研究中的瘤研究中的应应用用 四、四、mRNA差差别显别显示技示技术术的的应应用用n研究植物不同分化研究植物不同分化发发育育阶阶段的基因表达差异段的基因表达差异nVille Calzada和和Nuccio 狼尾草的基因表达狼尾草的基因表达n有性生殖和无融合生殖的子房有性生殖和无融合生殖的子房n2个个锚锚定引物和定引物和20个个10碱基随即引物共碱基随即引物共显显示出示出2268个个cDNA片段，其中有片段，其中有3个基因片段能在有性生殖的个基因片段能在有性生殖的子房中特异表达。子房中特异表达。四、四、mRNA差差别显别
20、显示技示技术术的的应应用用n在在营营养学中的养学中的应应用用 营营养物养物质质的作用与基因的作用与基因调调空有关，当某种空有关，当某种营营养缺乏或养缺乏或过过多多时时，在分子水平上就表，在分子水平上就表现为现为某个或某些基因的开启、关某个或某些基因的开启、关闭闭或表或表达量的达量的变变化化铜在营养学中的作用铜在营养学中的作用缺铜缺铜6周的大鼠肝脏周的大鼠肝脏mRNA正常大鼠肝脏正常大鼠肝脏mRNA10个个cDNA片段的差异片段的差异表达量是对照的倍表达量是对照的倍新的未知基因新的未知基因五、五、mRNA差差别显别显示在甜菜无融合生示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的殖基因克隆研究中的应应用用n被
21、子植物无融合生殖使其子代被子植物无融合生殖使其子代继继承了母本所有承了母本所有的的遗传遗传特性，并形成特性，并形成遗传遗传上上稳稳定的，可由种子定的，可由种子繁殖的无性系。由此可以保存繁殖的无性系。由此可以保存优优异的基因型，异的基因型，固定固定杂杂种种优势优势，并可能使一些重要的作物，并可能使一些重要的作物实现实现“一系法一系法”育种；如果无融合生殖被很好地利用，育种；如果无融合生殖被很好地利用，它将是二十世它将是二十世纪纪六十年代六十年代“绿绿色革命色革命”之后的又之后的又一次一次农业农业革命革命无性生殖革命。无性生殖革命。五、五、mRNA差差别显别显示在甜菜无融合生示在甜菜无融合生殖基因
22、克隆研究中的殖基因克隆研究中的应应用用 植物界中，无融合生殖广泛存在。我植物界中，无融合生殖广泛存在。我们们通通过过栽培甜菜（栽培甜菜（Beta vulgaris L.）与白花甜菜（）与白花甜菜（B.corollifora Zoss）远缘杂远缘杂交交获获得得了真了真实杂实杂种，种，经遗传经遗传回交回交获获得了得了带带有白花甜菜染色体的完整有白花甜菜染色体的完整单单体附加系系列，并且通体附加系系列，并且通过单过单体附加系体附加系传递传递研究，研究，筛选筛选出近出近100%高高频频率率传递传递的的单单体附加系体附加系M14品系。品系。经过标记经过标记基因基因杂杂交、交、传递遗传传递遗传形形态观态观
23、察、胚胎学及分子生物学察、胚胎学及分子生物学鉴鉴定它定它们们是兼是兼性无融合生殖的性无融合生殖的,1999年年3月月经专经专家家鉴鉴定定为为无融合生殖品系；无融合生殖品系；同同时时无融合生殖基因已无融合生殖基因已经经定位在定位在这这条附加的白花甜菜染色体条附加的白花甜菜染色体上，因此上，因此M14品系是克隆无融合生殖基因的极品系是克隆无融合生殖基因的极为难为难得的材料。得的材料。甜菜单体附加系甜菜单体附加系M14M14品系品系 (VV+1C,2n=19=18+1,(VV+1C,2n=19=18+1,箭头所指为附加的白花甜菜染色体箭头所指为附加的白花甜菜染色体 )五、五、mRNA差差别显别显示在
24、甜菜无融合生示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的殖基因克隆研究中的应应用用n采用采用mRNA差异差异显显示技示技术术比比较较甜菜无融合生殖甜菜无融合生殖系及正常系及正常进进行有性生殖的二倍体栽培植株在无行有性生殖的二倍体栽培植株在无融合生殖基因表达的三个关融合生殖基因表达的三个关键时键时期，即期，即大大孢孢子子母母细细胞减数分裂期、助胞减数分裂期、助细细胞提前退化期、次生胞提前退化期、次生核自行分裂期核自行分裂期mRNA的差异，是的差异，是进进行克隆无融行克隆无融合生殖相关基因的比合生殖相关基因的比较较有效的方法有效的方法 五、五、mRNA差差别显别显示在甜菜无融合生示在甜菜无融合生殖基因克隆研
25、究中的殖基因克隆研究中的应应用用n对总对总RNA进进行逆行逆转转录录反反应应，合成，合成cDNA第一第一链链。nPCR反反应扩应扩增：增：cDNA第一第一链链 1ul 25mM Mgcl2 Ex Taq酶酶（5U/l）50m锚锚定引物定引物 随机引物随机引物 10PCR 缓缓冲液冲液 H2 反反应应体系体系为为20ul 五、五、mRNA差差别显别显示在甜菜无融合生示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的殖基因克隆研究中的应应用用nPCR反反应应程序：程序：94,5min;94,30sec;42,lmin;72,30sec,40cycle。nPCR产产物利用物利用4%的非的非变变性聚丙性聚丙烯酰烯酰胺
26、凝胶胺凝胶进进行行电电泳，分离出泳，分离出M14与与A2Y相比相比较较而而对应对应的差异片段。的差异片段。n将差异片将差异片进进行回收、行回收、转转化。克隆化。克隆载载体体为为 PMD18-T Vector，按照按照-互互补补筛选筛选原原则则，挑取部分白色菌落，挑取部分白色菌落为为模板，按原程序模板，按原程序进进行行PCR扩扩增，增，琼琼脂糖脂糖凝胶凝胶电电泳分析，有插入片段的菌落泳分析，有插入片段的菌落应扩应扩增出一条与插入片段大小一致的增出一条与插入片段大小一致的片段，挑取阳性克隆菌落，穿刺培养后由上海博片段，挑取阳性克隆菌落，穿刺培养后由上海博亚亚生物技生物技术术有限公司有限公司测测序序，测测序后序后进进入入GenBank进进行序列同源性比行序列同源性比较较。n经经与与GenBank数据数据库库比比较较，发现发现AP-3片段片段与与B.Vulgaris mRNA for small GTP-binding protein 具有同源性。种蛋白基因被称具有同源性。种蛋白基因被称为为分分子开关，但是否与无融合基因的表达有关，子开关，但是否与无融合基因的表达有关，需要需要进进一步研究而一步研究而AP-4为为未知基因而。未知基因而。