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1、目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。直接从染色体直接从染色体DNA中分离中分离一、限制性内切酶法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同切成不同大小的片断。大小的片断。酶切酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。体连接。1. 优点优点2. 缺点缺点目的基因目的基因内部内部也可能有该内切酶的切点。也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene二、随机片断化二、随机片断化1. 限制性内切酶局部消化法限制
2、性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。切开。 内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。影响所切出的产物的长度和随机程度。1）4bp的内切酶的内切酶平均每平均每46（4096）bp一个切点。一个切点。2）6bp的内切酶的内切酶平均每平均每44（256）bp一个切点。一个切点。随机程度高。如随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。 内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）2. 机械切割法
3、机械切割法（1）超声波）超声波超声波强烈作用于超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约，可使其断裂成约300bp的随机片断。的随机片断。（2）高速搅拌）高速搅拌1500转转/分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约8kb的随机片断。的随机片断。（3）DNA溶液小孔喷射溶液小孔喷射注射器法可将注射器法可将100kb以上的以上的DNA剪切成剪切成10 kb左右左右的片段。的片段。1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法提出了用化学方法合成基因的设想，并于合成基因的设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸酸tRNA
4、基因的论文。基因的论文。第二节第二节 化学合成目的基因化学合成目的基因要求：要求：1、已知目的基因的核苷酸序列、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列或其产物的氨基酸序列 。2、分子量较小的目的基因的制备分子量较小的目的基因的制备 由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列* 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法固相合成法自动化合成法。自动化合成法。磷酸三酯法、磷酸三酯法、 保护保护dNTP的的5端端P 或或3端端-OH 用酸或碱的脱保护用酸或碱的脱保护（1）
5、原理）原理1. 磷酸二酯法磷酸二酯法 带保护的单核苷酸连接带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。保证合成反应的定向进行。带带5保护的单核苷酸与带保护的单核苷酸与带3保护的另保护的另一个单核苷酸以一个单核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键连接起来。连接起来。（2）合成过程）合成过程下一个下一个5端保护的单核苷酸又可以同端保护的单核苷酸又可以同3端保护的端保护的二核苷酸聚合。二核苷酸聚合。原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3-末端先以末端先以3-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连）连接，然后依次从接，然后依次从3-5的方向将核
6、苷酸单体加上去，的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。具体的合成和延伸过程如图。2.亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法化学合成的化学合成的DNA片断一般在片断一般在200bp以内。以内。二、二、 化学合成化学合成DNA片断的组装片断的组装 用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的5端带端带上磷酸。上磷酸。1. 互补连接法互补连接法 预先设计合成的片断之间都有预先设计合成的片断之间都有互补区互补区域域，不同片断之间的互补区域能形成有，不同片断之间的互补区域能形成有断断点点的完整双链。的
7、完整双链。（2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互补配对）互补配对（合成的（合成的DNADNA单链的单链的55端是端是-OH-OH）T4 DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双链双链（3 3）连接酶连成完整双链连接酶连成完整双链2. 互补延伸连接法互补延伸连接法预先设计的片断之间有预先设计的片断之间有局部互补区局部互补区，可以，可以相互作为另一个片断延长的引物，用相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶聚合酶延伸成完整的双链。延伸成完整的双链。355353T4DNA连接酶连接酶Klenow片段片段引物引物1. 直接合成基因直接合成基因三、
8、三、 寡聚核苷酸化学合成的优点寡聚核苷酸化学合成的优点2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难作的含量很低，很难作cDNA3. 合成探针序列合成探针序列4. 定点突变合成定点突变合成合成带有合成带有定点突变定点突变的基因片断。的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪合成仪5. 合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点含有各种酶切位点人工接头人工接头（Adaptor）或）或衔接物衔接物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptorPCR 可以把可以把 数
9、数量放大量放大染色体PCR 基因放大基因放大连琐连琐反反应应第四节第四节 从基因文库、从基因文库、cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因一、基因文库的构建一、基因文库的构建1. 基因文库（基因文库（gene library） 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割切割成大小合适的片断，并将成大小合适的片断，并将所有这些片断所有这些片断都与都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保保存和扩增存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的了该生物体的全部基因全部基因，因此，称之为基因，因此，称之为基因组
10、文库（组文库（genomic library）或基因文库（）或基因文库（gene library）。）。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内由克存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基隆载体所携带的所有基因组因组DNA的集合的集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因（2 2）目前常用的载体目前常用的载体 2. 构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到
11、构片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的建完整的基因文库所需要的重组子重组子的数目。的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目片断数目越少，所需的越少，所需的重组子重组子越少。越少。（1 1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列： 容量为容量为 24 kpcosmid载体：载体： 容量为容量为 50 kb YAC： 容量为容量为 1 MbBAC: 容量为容量为 300 kb断点完全随机，片断长度合适于载体连接。断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体）染色体DNA大片段的制备大片段
12、的制备3. 基因文库构建的一般步骤基因文库构建的一般步骤超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb）。）。 物理切割法：物理切割法：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化。可得到进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。 酶切法：酶切法：（2）载体与基因组）载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接 粘性末端直接连接粘性末端直接连接直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法人工接头法（adapter）同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 平端连接平端连接同聚物加尾连接同聚物加尾连接Bam
13、H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限
14、制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重
15、组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R4
16、. 基因组文库的大小基因组文库的大小一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所需要的克隆数目。时所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f: 插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组片断的平均长度占整个基因组DNA的的百分数百分数N：所需的重组载体数（克隆数：所需的重组载体数（克隆数）例如：从人基因组例如：从人基因组DNA（总长度为（总长度为3109bp）的文库中筛选到长约）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为目的基因的可能性为99，那么这个基因组文库要多大？，那么
17、这个基因组文库要多大？ ln（10.99） N = = 9.2106 ln （11.51033109） 三种常用基因组文库克隆载体的比较三种常用基因组文库克隆载体的比较载体种类载体种类装载量装载量转转 染染 率率噬菌体噬菌体 粘性质粒粘性质粒(Cosmid) 酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)922kb3045kb1001000kb105106转化子转化子gDNA104106转化子转化子gDNA 500转化子转化子gDNA1.cDNA library二、二、 cDNA文库的构建文库的构建利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些这些cDNA与载体连接，转入细菌
18、细胞中进与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称行保存和扩增，称cDNA文库。文库。2.cDNA (complementary DNA，互补，互补DNA)是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的内的mRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNA。4. 构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取3. cDNA文库的特点文库的特点提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。 利用利用mRNA都
19、含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，将将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化 原理原理 mRNA的分离纯化的分离纯化Column（柱）（柱）反转录酶反转录酶mRNAcDNA355AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物（3）cDNA的合成的合成 cDNA第一链合成第一链合成oligo(dT)引导的引导的DNA合成法：合成法：利用真核利用真核mRNA分子所具有的分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的个脱氧胸腺嘧啶核
20、苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶短片段，由反转录酶合成合成cDNA的第一链。的第一链。随机引物引导的随机引物引导的cDNA合成法合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ： 根据许多可能的序列，合成出根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应的引物。在应用这种混合引物的情况下，用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从的合成可以从mRNA模板模板的许多位点同时发生，而不仅仅从的许多位点同时发生，而不仅仅从3-末端的末端的oligo(d
21、T)引物一引物一处开始。处开始。用用碱碱处理或用处理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3355反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3355引物引物cDNA第一链第一链35引物引物 降解降解mRNA模板模板或或RNaseH碱碱 cDNA第二链合成第二链合成剩下的剩下的cDNA单链的单链的3末端一般形成一个末端一般形成一个弯回来的弯回来的双链发卡结构双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用链的引物。用DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链DNA。a.自身引导合成法：自身引导合
22、成法：cDNA第一链第一链5cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链53去掉发卡结构去掉发卡结构核酸酶核酸酶S1用用核酸酶核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会可以切掉发卡结构（但这会导致导致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链53cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5353优点：优点：a）合成合成cDNA的效率高的效率高 b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用避免使用S1核酸酶来切割双链核酸酶来切割双链cDNA在双链在双链cDNA末端接上末
23、端接上人工接头人工接头，即可与载体连接，即可与载体连接，转入受体菌。转入受体菌。或借助或借助末端转移酶末端转移酶给载体和双链给载体和双链cDNA的的3端分别加端分别加上几个上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。(4)(4)cDNA与载体连接：与载体连接：接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶(5)(5)5. cDNA文库的大小文库的大小一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的的mRNA时时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1- )p: 文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）: 某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整个占细胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）1n1n基因组基因组DNADNA文库文库c cDNADNA文库文库三、基因组DNA文库与cDNA文库的比较1 1、表型筛选法、表型筛选法(3)(3)显色反应选择法显色反应选择法(-(-互补法互补法) )2 2、PCRPCR筛选法筛选法(1)抗药性筛选抗药性筛选4 4、免疫筛选法、免疫筛选法