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1、血清蛋白质聚丙烯血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳酰胺凝胶圆盘电泳第六组 蛋白质的分离v蛋白质是生物大分子化合物，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点蛋白质分离纯化的方法主要有：盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。透析透析超速离心超速离心凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析电泳技术的原理电泳技术的原理v电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同，其在电场中的泳动速率也不同，从而将蛋白质分离成泳动速率快慢不等的条带。v电荷的来源 蛋白质带有可解离的氨基（-NH2）和羧基(-COOH),是典型的
2、两性电解质，在一定PH条件下会解离带上电荷COO-COO-COOH +H+H+Pr Pr Pr +OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PH蛋白质阴离子甘氨酸阴离子垂直板电泳的优点：垂直板电泳的优点：1.表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。2.可多个样品的电泳3.胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高。4.胶版薄而透明，可制成干板，便于长期保存与扫描。5.可进行双向电泳。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只可以分离出56条区带，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分离出数十条区带。v实验器材与试剂1器材圆盘电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、微量加样器、注射器、小烧杯
3、2试剂（缓冲液PH值准确配置后用PH计调试）试剂编号试剂名称配置14*分离胶缓冲液1mol/L盐酸24.0mL/100mL,Tris 18.2g/100mL(pH 8.9)230%单体交联剂丙烯酰胺30.0g与甲叉双丙烯酰胺0.8g 100mL3催化剂10%过硫酸铵（临用前配置）4加速剂TEMED 1mL加蒸馏水到10mL54*浓缩胶缓冲剂mol/L 盐酸48mL/100mL,Tris 5.98g/100mL(pH6.7)610*电极缓冲剂甘氨酸28.8g与Tris 6.0g 加蒸馏水至100mL 稀释(pH 8.3)临用前十倍稀释72*上样缓冲剂溴酚蓝0.05g 20mL甘油，加5号试剂25
4、mL，定溶至100mL8固定液三氯乙酸12.50g 加蒸馏水至100mL9考马斯亮蓝R250染色液1.25g考马斯亮蓝R250,溶于227mL甲醇中加蒸馏水227mL冰醋酸46mL10脱色液甲醇:冰醋酸:水按3:1:6比例配合v实验操作1.凝胶柱的准备（凝胶溶液配制表见教材表4-4）取 玻 璃 管，一 段 封 口加入分离胶溶 液(7 c m)加入蒸馏水制备分离胶应迅速为了使表面平整，与空气隔绝静 置 待 凝 胶聚合浓缩胶制备(1cm)吸取上表面蒸馏水待凝胶与水面的界面重新可辨切勿触动胶面参见分离胶加入分离胶溶 液(7 c m)制备分离胶应迅速加入分离胶溶 液(7 c m)制备分离胶应迅速加入分
5、离胶溶 液(7 c m)制备分离胶应迅速加入分离胶溶 液(7 c m)制备分离胶应迅速加入蒸馏水为了使表面平整，与空气隔绝取 玻 璃 管，一 段 封 口加入分离胶溶 液(7 c m)制备分离胶应迅速取 玻 璃 管，一 段 封 口加入分离胶溶 液(7 c m)制备分离胶应迅速取 玻 璃 管，一 段 封 口加入蒸馏水为了使表面平整，与空气隔绝加入分离胶溶 液(7 c m)制备分离胶应迅速取 玻 璃 管，一 段 封 口2.装柱 将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜)3.加样 取血清
6、12L，7号试剂12L混匀，品均加入4管，每管6L.（加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散。）4.电泳 接通电源，上负下正，先调节电流1mA/管，待示踪染料进入分离胶后调节为23 mA/管，待示踪染料离管下口时切断电源。5.剥胶 注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离。6.固定、染色及漂洗 将凝胶柱浸入8号剂中泡10min，进行固定，用9号剂染色10min，用清水冲洗，放入10号剂中漂洗脱色。v结果示意图 2 1注意事项：1.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避
7、免直接接触注意避免直接接触2.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值值是否失效。是否失效。失效液不能聚合。失效液不能聚合。3.加速剂（加速剂（TEMED）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，防止氧化防止氧化失效。失效。4.配好胶后应尽快灌胶（配好胶后应尽快灌胶（不要形成气泡不要形成气泡）5.切记装柱后应用蒸馏水密封切记装柱后应用蒸馏水密封6.灌胶和电泳时要注意排气泡灌胶和电泳时要注意排气泡7.加样时不能损伤凝胶表面加样时不能损伤凝胶表面8.电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直9.固体胶切忌倒入水池固体胶切忌倒入水池The end!谢谢！