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1、血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyAcrylamideGelElectrophoresis(PAGE)pp61 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合蛋白质的原理；熟悉聚丙离混合蛋白质的原理；熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操作技术。作技术。目的与要求：目的与要求：q制备凝胶制备凝胶q安装凝胶管安装凝胶管q加加样样（血血清清样样品品15-20L、其其中中含含甘甘油油、溴酚兰）溴酚兰）q电泳（电泳（3mA/管）管）q剥胶剥胶 q染色和脱色染色和脱色操作步骤操作步骤实验原理：实验原理：q 聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺
2、胺是是是是由由由由丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺和和和和交交交交联联联联剂剂剂剂亚亚亚亚甲甲甲甲基基基基双双双双丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺在在在在催催催催化化化化剂剂剂剂作作作作用用用用下下下下，聚聚聚聚合合合合交交交交联联联联而而而而成成成成，具具具具有有有有网网网网状状状状立立立立体体体体结结结结构构构构的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶，并并并并以以以以此此此此为为为为支支支支持持持持物物物物在在在在垂垂垂垂直直直直的的的的玻玻玻玻璃璃璃璃管管管管中中中中进进进进行行行行电电电电泳泳泳泳，电电电电泳泳泳泳分分分分离离离离的的的的区区区区带带带带类类类类似似似似圆圆圆圆盘盘盘盘状状状状故故故
3、故命命命命名名名名为为为为圆盘电泳。圆盘电泳。圆盘电泳。圆盘电泳。结果结果聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续连续电泳电泳和和不连续不连续电泳电泳两类两类 连续电泳连续电泳指整个电泳系统中所用指整个电泳系统中所用缓冲缓冲液，液，pH值和凝胶网孔的值和凝胶网孔的孔径孔径都是相同的。都是相同的。不连续电泳不连续电泳是指在电泳系统中采用了是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓两种或两种以上的缓冲冲液，液，pH值和孔径值和孔径。q具有具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。不连续圆盘电泳的凝胶管中置有两种不连续圆盘电泳的凝胶管中置有两种不同的凝胶层：浓缩胶
4、、分离胶。不同的凝胶层：浓缩胶、分离胶。不连续电泳能使稀的样品在电泳过程不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中中浓缩浓缩成层，从而提高分辨能力成层，从而提高分辨能力浓缩胶的浓缩效应浓缩胶的浓缩效应电极缓冲液：电极缓冲液：Tris-Gly溶液（）溶液（）浓缩胶缓冲液：浓缩胶缓冲液：Tris-Cl溶液（）溶液（）分离胶缓冲液：分离胶缓冲液：Tris-Cl溶液（）溶液（）溶液中主要的负离子：溶液中主要的负离子：pI:血清蛋白质（左右）血清蛋白质（左右）甘氨酸（）甘氨酸（）以及完全解离的以及完全解离的Cl离子离子形成先导离子（快离子）、尾随离子（慢离子）形成先导离子（快离子）、尾随离子（慢离子）P26P2
5、6 在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在时很少解离，其有效泳动速率很低，而氯离子却有很高的泳动速率，蛋白质的泳动速率介于两者之间。加上电压以后，作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸离子的泳动，使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同的速度泳动，两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低，因此氯离子能迅速越过
6、。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速率比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，形成一条狭窄的区带。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的pH明显增加，导致甘氨酸大量解离。此时，甘氨酸的有效泳动速率明显增加，超越蛋白分子，直接在氯离子后移动。由于凝胶孔径变小，蛋白质分子的迁移速率降低，落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和pH环境中泳动，并根据其固有的电荷与分子大小进行分离。可见，甘氨酸并非作为缓冲成分甘氨酸并非作为缓冲成分参与，而是作为尾随离子来参与电泳过程。q制备凝胶制备凝胶q安装凝胶管安装凝胶管q加加样样（血
7、血清清样样品品15-20L、其其中中含含甘甘油油、溴酚兰溴酚兰）q电泳（电泳（3mA/管）管）q剥胶剥胶 q染色和脱色染色和脱色操作步骤操作步骤制备凝胶制备凝胶分离胶分离胶浓缩胶浓缩胶（过硫酸铵后加）（过硫酸铵后加）1%AP：过硫酸铵（引发剂）过硫酸铵（引发剂）1%TEMED：四甲基乙二胺（催化剂）四甲基乙二胺（催化剂）引发剂在凝胶形成中提供自由基，通过自由基的传递，引发剂在凝胶形成中提供自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，导致聚合反应。使丙烯酰胺成为自由基，导致聚合反应。催化剂则可加快引发剂产生自由基的速度。催化剂则可加快引发剂产生自由基的速度。注意事项注意事项：q丙丙烯烯酰酰胺胺和和亚亚甲甲基基双双丙丙烯烯酰酰胺胺具具有有神神经经毒性，避免呼吸道吸入和皮肤接触。毒性，避免呼吸道吸入和皮肤接触。q电泳注意用电安全。电泳注意用电安全。q制备凝胶制备凝胶q安装凝胶管安装凝胶管q加加样样（血血清清样样品品15-20L、其其中中含含甘甘油油、溴酚兰）溴酚兰）q电泳（电泳（3mA/管）管）q剥胶剥胶 q染色和脱色染色和脱色操作步骤操作步骤