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1、关于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质现在学习的是第1页，共28页聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)(Acr)和交联剂和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)在加速剂四甲基乙二胺在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)和和催化剂过硫酸铵催化剂过硫酸铵(NH(NH4 4)2 2S S2 2O O8 8，AP)AP)的作用下聚合交联成三的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)。实验原理实验原理现在学
2、习的是第2页，共28页 TEMED（加速剂）（加速剂）过硫酸铵过硫酸铵 硫酸根自由基（催化剂）硫酸根自由基（催化剂）Acr（双链）（双链）Acr（长链）（长链）+Bis(交联剂交联剂)PAG凝胶凝胶现在学习的是第3页，共28页 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。电荷效应电荷效应 （电泳物所带电荷的差异性）（电泳物所带电荷的差异性）浓缩效应浓缩效应 （四个不连续性形成）（四个不连续性形成）分子筛效应分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致）大小形状
3、不同所致）现在学习的是第4页，共28页n不连续体系由不连续体系由凝胶层、缓冲液离子成分、电位梯度、凝胶层、缓冲液离子成分、电位梯度、pHpH因素因素所组成。所组成。浓缩胶浓缩胶是大孔是大孔径，径，分离胶分离胶是小孔径；是小孔径；ClCl-为快离子、甘氨酸根离子为慢离子、为快离子、甘氨酸根离子为慢离子、TrisTris为缓冲配对离为缓冲配对离子子,Cl,Cl-PrGlyPrGly-;浓缩胶缓冲液为浓缩胶缓冲液为pH6.7 pH6.7，分离胶缓冲液为，分离胶缓冲液为pH8.9 pH8.9；电极缓冲液电极缓冲液是是pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液;电位梯度的差异是
4、自动形成的，在快离子与慢离子之间形电位梯度的差异是自动形成的，在快离子与慢离子之间形成电位梯度，由于成电位梯度，由于PrPr的有效迁移率介于快慢离子之间故也就聚集在这个移动的界的有效迁移率介于快慢离子之间故也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成狭小的中间层；面附近，被浓缩成狭小的中间层；2 2种孔径的凝胶、种孔径的凝胶、3 3种缓冲体系、种缓冲体系、3 3种种pHpH值使不值使不连续体系形成了，样品得到浓缩。连续体系形成了，样品得到浓缩。现在学习的是第5页，共28页 样品浓缩效应样品浓缩效应(a)(a)凝胶孔径不连续性：凝胶孔径不连续性：(b)(b)缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH
5、值的不连续性；值的不连续性；n在在pH6.7pH6.7的凝胶缓冲体系中的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：前导离子或快离子：HC1HC1解离出的氯根解离出的氯根(C1(C1-)尾随离子或慢离子：甘氨酸根尾随离子或慢离子：甘氨酸根n当进入当进入pH8.9pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；移率超过蛋白质；（c)c)电位梯度的不连续性：电位梯度的不连续性：现在学习的是第6页，共28页现在学习的是第7页，共28页n分子筛效应分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，
6、受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。，这就是分子筛效应。n电荷效应电荷效应电荷量不同，迁移率不同。电荷量不同，迁移率不同。现在学习的是第8页，共28页实验仪器实验仪器n 电泳装置电泳装置稳压电源稳压电源盘状电泳槽盘状电泳槽现在学习的是第9页，共28页n 刻度吸量管刻度吸量管n 玻璃管和橡胶帽玻璃管和橡胶帽现在学习的是第10页，共28页n 培养皿培养皿n 微量移液器微量移液器现在学习的是第11页，共28页n 脱色摇床脱色摇床n 注射器和长针头注射器和长针头现在学习的是第12页，共28页实验试剂实验试剂n丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)(
7、Acr)和甲叉双丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)uAcrAcr的重结晶的重结晶uBis重结晶重结晶 （注意固体（注意固体AcrAcr和和BisBis应贮存应贮存棕色瓶中，应贮存应贮存棕色瓶中，在干燥、低温和暗处保存，并注意避免超声波、在干燥、低温和暗处保存，并注意避免超声波、-辐射和自然光的照射）辐射和自然光的照射）现在学习的是第13页，共28页n TEMED-TEMED-四甲基乙二胺，避免冰箱保存。四甲基乙二胺，避免冰箱保存。n 过硫酸铵过硫酸铵(不能潮解，否则不能用不能潮解，否则不能用)n 染色液：用染色液：用0.05N NaOH0.05N NaOH配制配制0.10.1溴酚兰液
8、溴酚兰液n 洗脱液：洗脱液：7 7醋酸醋酸n 其他试剂：见下表贮存液的配制。按表其他试剂：见下表贮存液的配制。按表1配制各贮存配制各贮存液置冰箱中贮存，可放液置冰箱中贮存，可放12月（但过硫酸铵液贮存冰月（但过硫酸铵液贮存冰箱不能超过一周）。箱不能超过一周）。现在学习的是第14页，共28页现在学习的是第15页，共28页实验步骤实验步骤n1、准备、准备n每人取电泳管每人取电泳管1支，标好号码，并在距电泳管下端支，标好号码，并在距电泳管下端7cm和和7.5cm处画横线做标记，在橡胶帽中滴处画横线做标记，在橡胶帽中滴1滴蔗糖溶液后，滴蔗糖溶液后，套在电泳管底端。套在电泳管底端。现在学习的是第16页，
9、共28页2、制胶、制胶：取小烧杯：取小烧杯2 2个，按表加液个，按表加液现在学习的是第17页，共28页n 3.灌柱灌柱 按上述操作，把分离胶溶液混匀，用滴管将分离胶溶液加入到电泳管中，按上述操作，把分离胶溶液混匀，用滴管将分离胶溶液加入到电泳管中，高至高至7cm处。然后在胶面上沿管壁缓缓注入处。然后在胶面上沿管壁缓缓注入0.5cm高的水层，切勿高的水层，切勿打乱凝胶液面，静置打乱凝胶液面，静置30min左右。左右。待分离胶成胶后，用细滤纸条吸干上层水分，灌浓缩胶至待分离胶成胶后，用细滤纸条吸干上层水分，灌浓缩胶至7.5cm处，再处，再小心沿管壁加小心沿管壁加DDW高约高约0.5cm，静置，静置
10、15min左右。左右。该浓缩胶成胶后，弃去上层水分，拔出橡胶帽。该浓缩胶成胶后，弃去上层水分，拔出橡胶帽。现在学习的是第18页，共28页 n 4、样品液制备：、样品液制备：n血清血清:0.1mln40%蔗糖蔗糖:0.1ml 于一于一0.5mlEP管中混匀备用管中混匀备用n0.05%溴酚兰溴酚兰:0.1ml现在学习的是第19页，共28页n 5、装电泳管：、装电泳管：先将电泳缓冲液倒入下槽，再将电泳管装到电泳槽内，先将电泳缓冲液倒入下槽，再将电泳管装到电泳槽内，用电泳缓冲液灌满胶管底部空隙，排净空气，注意对称用电泳缓冲液灌满胶管底部空隙，排净空气，注意对称放置，使其散热均匀。最后将上槽灌满缓冲液，
11、排净电放置，使其散热均匀。最后将上槽灌满缓冲液，排净电泳管里的气泡。泳管里的气泡。6、上样：、上样：用微量加样器吸样品液用微量加样器吸样品液10ul，加在浓缩，加在浓缩胶上正中央。胶上正中央。现在学习的是第20页，共28页n 7、电泳：、电泳：n上槽上槽负极负极 下槽下槽正极正极n电流：先浓缩胶电流：先浓缩胶:1.5mA/管管 然后分离胶然后分离胶:3.0mA/管管现在学习的是第21页，共28页n 8、剥胶、剥胶 电泳毕，取下电泳玻管，用一长针头注射器电泳毕，取下电泳玻管，用一长针头注射器(针针头长约头长约68厘米厘米)，吸满蒸馏水为润滑剂，将，吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表
12、面之间，缓缓旋针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水，一边使针头慢慢呈螺旋式转玻管，一边注水，一边使针头慢慢呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。力，就可将凝胶柱压出玻管。现在学习的是第22页，共28页9、固定和染色：固定和染色：先用固定液固定先用固定液固定5分钟，再在培养皿中装染色液，摇床染色分钟，再在培养皿中装染色液，摇床染色10min。10、脱色：、脱色：加加7%冰醋酸摇床脱色，三次，每次冰醋酸摇床脱色，三次，每次23min，一周之后观察结，一周之后观察结果。果。11、定量：、定量：光密度扫描仪
13、定量。光密度扫描仪定量。现在学习的是第23页，共28页现在学习的是第24页，共28页实验结果实验结果+n观看结果，描出血清电泳区观看结果，描出血清电泳区带图谱，确定清蛋白有无异常带图谱，确定清蛋白有无异常。现在学习的是第25页，共28页n 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。n 制胶时，要充分摇匀，加速剂制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMEDTEMED最后加。最后加。n 注意观察实验现象：分界面，浓缩效应。注意观察实验现象：分界面，浓缩效应。n 溴酚兰染色溴酚兰染色脱色脱色染液回收。染液回收。n 固体胶切忌倒入水池固体胶切忌倒入水池。注意事项注意事项现在学习的是第26页，共28页思考题思考题n聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率为什么聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率为什么比醋酸纤维薄膜电泳高？比醋酸纤维薄膜电泳高？n电泳的分子筛效应与凝胶过滤的分子电泳的分子筛效应与凝胶过滤的分子筛效应原理上有何不同？筛效应原理上有何不同？n电泳灌胶时表面要加盖一层水，为什电泳灌胶时表面要加盖一层水，为什么？么？现在学习的是第27页，共28页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第28页，共28页