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1、实验二、实验二、ELISPOT 单细胞分析技术单细胞分析技术基础医学院免疫学教研室基础医学院免疫学教研室 徐琦徐琦 副教授副教授ELISPOTELISPOT简介简介 ELISPOT ELISPOT是在是在ELISA ELISA 技术的基础上建立的体技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和外检测特异性抗体分泌细胞和 CK CK 分泌细胞的固分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。相酶联免疫斑点技术。可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞，并具有较高的特异性和敏感和细胞因子的细胞，并具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用。性，目前正被国
2、内外广泛应用。ELISPOTELISPOT技术的发展技术的发展 lELISPOTELISPOT是是2020多年前便己研发成功的老技术。多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky Czerkinsky 等等人率先在人率先在19831983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的体的B B细胞频率。细胞频率。l早期早期ELISPOTELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。l直到直到19961996年年PVDFPV
3、DF薄膜的应用（薄膜的应用（Forsthuber et al.,Forsthuber et al.,Science,1996Science,1996），才解决了该技术因斑点呈色问题造成低），才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDFPVDF薄膜提供薄膜提供1,0001,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使倍的较大面积来吸附单株抗体，使T T细胞分泌的各类细细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高对比色高，大大的提高ELISP
4、OT CytokineELISPOT Cytokine分析的敏感度。分析的敏感度。19961996年以来随着抗体制备、年以来随着抗体制备、PVDFPVDF膜等技术改良，膜等技术改良，ELISPOT ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特异性是当世公认最灵敏抗原特异性T T细胞的体外检测技术。细胞的体外检测技术。ELISPOTELISPOT与与ELISAELISA的比较的比较它们最大的不同在于：它们最大的不同在于：l1.ELISA1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲通过显色反应，在酶标仪上测定吸
5、光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。线比较得出可溶性蛋白总量。l2.ELISPOT2.ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过数斑点或通过ELISPOTELISPOT分析系统对斑点进行计数，分析系统对斑点进行计数，1 1个斑点代表个斑点代表1 1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率;l3.3.由于是单细胞水平检测，由于是单细胞水平检测，ELISPOTELISPOT比比EL
6、ISAELISA和有限稀释法等和有限稀释法等更灵敏，能从更灵敏，能从2020万万-30-30万细胞中检出万细胞中检出1 1个分泌该蛋白的细胞。个分泌该蛋白的细胞。l4.4.刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。10106 6抗原呈递细胞（抗原呈递细胞（APCAPC）中混入）中混入特定数量的特定数量的IFN-IFN-+的的T T淋巴细胞淋巴细胞 ，经下列方法检测：，经下列方法检测：ELISPOTELISPOT 细胞内细胞因子染色（细胞内细胞因子染色（FACSFACS）ELISAELISAX X坐标：坐标：10106 6 APCAPC中实际
7、中实际IFN-IFN-+T T细胞数量细胞数量Y Y坐标：坐标：各检测方法的检测结果各检测方法的检测结果 ELISPOT/FACS/ELISA ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较检测精确度比较BD ELISPOT 技术优势技术优势l单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子l观察活细胞应答（动态）结果能计数效应细胞，分析效应分观察活细胞应答（动态）结果能计数效应细胞，分析效应分子产生频率子产生频率of Spots:cell numbers/frequencyof Spots:cell numbers/frequencysize of Spots:re
8、lative amount producedsize of Spots:relative amount producedl高灵敏度高灵敏度,高产量高产量,大容量大容量T T 细胞分析成为可行。细胞分析成为可行。l只需要少量样本即可进行检测分析。只需要少量样本即可进行检测分析。l淋巴细胞在淋巴细胞在 ELISPOT ELISPOT 分析后依然存活。这使得分析之后可分析后依然存活。这使得分析之后可以用于进行增殖，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏以用于进行增殖，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。成为可能。BD ELISPOT 应用应用l移植研究移植研究l疫苗开发疫苗开发-亦可评估疫苗
9、效力，或是疫苗注射路径影响亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 lTh0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2细胞转换分析细胞转换分析 l自体免疫研究自体免疫研究 免疫调节及免疫治疗研究免疫调节及免疫治疗研究 l癌症研究癌症研究-肿瘤反应肿瘤反应T T细胞作用细胞作用 l过敏机制探讨过敏机制探讨 IL-4 IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子研究敏机制之细胞因子研究 l传染疾病研究传染疾病研究l体液免疫研究体液免疫研究 B B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究究 BD ELISPOTBD ELIS
10、POT原理原理实验设计是在实验设计是在9696微孔培养板底部披覆微孔培养板底部披覆PVDFPVDF薄膜，用来吸附特薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含殊挑选、且无毒性（不含sodium azidesodium azide、内毒素、内毒素endotoxinendotoxin）的单株抗体。）的单株抗体。2.2.静脉血静脉血PBMCPBMC经适当分离处理后分配到微孔上，再接受适当经适当分离处理后分配到微孔上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆性一般而言，记忆性T T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞在
11、受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子，此时局部细胞因子，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞分泌出的细胞因子会被因子会被PVDFPVDF薄膜上特异抗体捕获。薄膜上特异抗体捕获。3.3.微孔板中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进微孔板中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步使用一步使用 生物素（生物素（BiotinBiotin）标记的一抗来标识，其后再与）标记的一抗来标识，其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，辣根过氧化物酶标记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞会留下约有反应作用的细胞会留下约10-20mm10-2
12、0mm大小染色的斑点。大小染色的斑点。BD ELISPOT BD ELISPOT 流程流程1 1针对被分析物的针对被分析物的 捕获抗体包被在贴有捕获抗体包被在贴有PVDFPVDF膜的微孔板上膜的微孔板上2 2用完全培养基将板用完全培养基将板底封闭底封闭3 3细胞悬液加入细胞悬液加入AgAg或有丝分裂或有丝分裂素等刺激剂孵育一定时间以激素等刺激剂孵育一定时间以激活细胞活细胞细胞分泌的蛋白紧细胞分泌的蛋白紧靠在细胞周围，与已固定的捕靠在细胞周围，与已固定的捕获抗体结合获抗体结合4 4孵育一定时间后洗去细孵育一定时间后洗去细胞胞,分泌出的细胞因子会被分泌出的细胞因子会被PVDFPVDF薄膜上特异抗体
13、捕获薄膜上特异抗体捕获BD ELISPOT 流程流程5 5加加入入生生物物素素标标记记的的针针对对被被分分析析物物的的检检测测抗抗体体检检测测抗抗体体与与被被分分析析物物结结合合，形形成成 夹心三明治夹心三明治复合物复合物6 6加加入入与与辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶(HRP)(HRP)连连接接的的亲亲和和素素亲亲和和素素与与检检测测抗体上的生物素结合抗体上的生物素结合7.7.加加入入底底物物与与酶酶发发生生显显色色反反应应，监监测测颜颜色色斑斑点点的的形形成成，终终止止底底物物反反应应，室室温温风风干干，避避光光保保存存于于封封口口塑塑料料袋袋中直至分析颜色斑点中直至分析颜色斑点BD ELI
14、SPOT 流程流程Coating Ab包被培养板0.05%PBS-Tween20(PBST)洗板5次每孔加入1%BSA阻断按实验设计加入含或不含刺激剂的培养液及一定数目细胞孵育5-24小时40C过夜370C孵育1小时取外周血单核细胞或脾淋巴细胞根据实验要求，培养液中加入所需刺激物，预先将所检测细胞孵育24-42小时无菌直接取外周血单核细胞或脾淋巴细胞或者BD ELISPOT 基本流程基本流程去除细胞，加入冰冻去离子水200ul/孔，培养板置冰上10分钟 加入生物素标记的detector Ab加入酶标抗生物素抗体(GABA)40C暗处混合显色剂I和II,加入显色剂I/II,暗处室温孵育20-30
15、分钟 PBST洗板10次370C孵育1小时后，PBST洗板5次370C孵育1小时后，PBST洗板5次显微镜下观察至斑点形成，去离子水清洗培养板 室温干燥后在倒置显微镜下观察结果非无菌ELISPOT ELISPOT 结果显示结果显示ELISPOT ELISPOT 结果显示结果显示Blank controls:G1-9:无刺激剂的细胞H1-9:无细胞的刺激剂样本孔出现颜色斑点Usu.1020 mmBD ELISPOT BD ELISPOT 结果分析结果分析 v在显微镜下计数，一个斑点代表一个分泌细胞在显微镜下计数，一个斑点代表一个分泌细胞v用用ElispotElispot Reader Reade
16、r 进行分析进行分析对斑点自动计数，并对斑点自动计数，并做出不同大小斑点的分布图，快速、精确、还能平做出不同大小斑点的分布图，快速、精确、还能平衡背景信号。衡背景信号。v软件自动计算出细胞的分泌频率软件自动计算出细胞的分泌频率 BD ELISPOT BD ELISPOT 操作注意事项操作注意事项1 1l1.1.操作时注意不要触及操作时注意不要触及PVDFPVDF膜的底部。膜的底部。l2.2.为获得优化的实验结果，在第一次实验时可使用不同的为获得优化的实验结果，在第一次实验时可使用不同的细胞浓度（细胞浓度（10103 310106 6cells/microwell)cells/microwell
17、)。l3.3.在细胞培养过程中不要摇动在细胞培养过程中不要摇动ELISPOTELISPOT板，防止斑点模糊。板，防止斑点模糊。l4.4.在培养箱孵育过程中，不要将在培养箱孵育过程中，不要将ELISPOTELISPOT板重叠，防止边缘板重叠，防止边缘效应。效应。l5.5.背景过高的克服方法：背景过高的克服方法：增加洗涤的次数。增加洗涤的次数。在显色之前用在显色之前用PBSPBS洗涤以去除洗涤以去除Tween-20Tween-20，防止对显色的干扰。，防止对显色的干扰。如果需要如果需要,增加干燥增加干燥ELISPOTELISPOT板的时间。板的时间。彻底洗去细胞减少非特异性斑点。彻底洗去细胞减少非
18、特异性斑点。掌握好显色时间，防止过度显色。掌握好显色时间，防止过度显色。l6.6.实验结束后将实验结束后将ELISPOTELISPOT板室温晾干，不能高于板室温晾干，不能高于3737防止损坏防止损坏PVDFPVDF膜。膜。l7.7.待待ELISPOTELISPOT板干燥后，将其保存在密封的塑料袋中防止褪色。板干燥后，将其保存在密封的塑料袋中防止褪色。BD ELISPOT BD ELISPOT 操作注意事项操作注意事项2 2ChampSpot酶联斑点分析系统简介Bioreader 3000Bioreader 3000TMTM PRO PRO 酶联斑点自动图象分析仪酶联斑点自动图象分析仪适用于分析
19、：适用于分析：酶联斑点酶联斑点(E El lispotispot)克隆形成克隆形成（CFUCFU）病毒斑病毒斑ELISPOTELISPOT酶联斑点分析软件酶联斑点分析软件和和ELISPOTELISPOT计数分析软件计数分析软件1 1、完成整块板的计数只需、完成整块板的计数只需5 5个步骤。个步骤。2 2、整块板的采集、分析、数据保存、输出，在、整块板的采集、分析、数据保存、输出，在1515分钟内完成分钟内完成3 3、强大的斑点处理功能、强大的斑点处理功能 4 4、图象自动修复：可自动减切修复每个孔的内圈图象，有效的、图象自动修复：可自动减切修复每个孔的内圈图象，有效的区分了孔壁与孔底的连接处。
20、区分了孔壁与孔底的连接处。5 5、具有单、双、多色斑点分析功能。、具有单、双、多色斑点分析功能。6 6、分析模式：给用户提供全自动、半自动、手动三种分析模式，、分析模式：给用户提供全自动、半自动、手动三种分析模式，同时可任意指定对整块同时可任意指定对整块ELISPOTELISPOT板、列、行或单个微孔进行分析。板、列、行或单个微孔进行分析。ELISPOTELISPOT酶联斑点分析软件酶联斑点分析软件和和ELISPOTELISPOT计数分析软件计数分析软件7 7、单个孔的图片或整块板的图片都可直接，复制或导入到单个孔的图片或整块板的图片都可直接，复制或导入到PhotoshopPhotoshop、
21、PowerPointPowerPoint、WordWord、等软件中进行编辑，同时、等软件中进行编辑，同时可将图片转换成可将图片转换成TIFFTIFF或者或者JPEGJPEG格式保存。格式保存。8 8、整块板或单个孔的数据表格都能保存、打印，并且可直接整块板或单个孔的数据表格都能保存、打印，并且可直接导入、复制到导入、复制到ExcelExcel与与WordWord进行编辑。进行编辑。9 9、专利设计斑点柱形图：拥有可显示斑点个数、面积、直径、专利设计斑点柱形图：拥有可显示斑点个数、面积、直径、含量等结果的可任意旋转三维立体图，以及独特的两维立体含量等结果的可任意旋转三维立体图，以及独特的两维立体图。图。1010、重复计数功能：保存的图片、数据可随时进行重新分析确、重复计数功能：保存的图片、数据可随时进行重新分析确保数据准确无误。保数据准确无误。