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1、蛋白质的测定蛋白质的测定蛋白质的组成及方法简介蛋白质的组成及方法简介:乳中的蛋白质约占乳成分的乳中的蛋白质约占乳成分的3-4%3-4%，在体内可，在体内可以产生热能，乳中的蛋白质可分为酪蛋白与乳清以产生热能，乳中的蛋白质可分为酪蛋白与乳清蛋白，将牛乳加酸调到（蛋白，将牛乳加酸调到（2020）的等电点所沉淀）的等电点所沉淀的蛋白质为酪蛋白，而乳清蛋白质残留在溶液中。的蛋白质为酪蛋白，而乳清蛋白质残留在溶液中。组成：组成：蛋白质主要由蛋白质主要由C.H.O.N.S.C.H.O.N.S.组成。组成。方法：方法：凯氏定氮仪常量检测法凯氏定氮仪常量检测法 半微量凯氏定氮法半微量凯氏定氮法 实验原理实验原
2、理:1.1.有机物中的氮在强热和有机物中的氮在强热和CuSOCuSO4 4，浓，浓H H2 2SOSO4 4 作用下，作用下，消化生成（消化生成（NHNH4 4）2SO2SO4 4反应式为：H2SO4=SO2+H2O+O R.CH.COOH+O=R.CO.COOH+NH3 R.CO.COOH+O=nCO2+mH2O 2NH3+H2SO4=(NH4)2SO42.2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NHNH3 3，收集于，收集于 H H3 3BOBO3 3 溶液中。溶液中。反应式为:2NH4+OH-=NH3+H2O NH3+H3BO3=NH4+H2BO3
3、-3.3.再用已知浓度的硫酸标准溶液滴定，根据硫酸再用已知浓度的硫酸标准溶液滴定，根据硫酸消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。子，既得蛋白质的含量。实验试剂：实验试剂：H H2 2SO4SO4标准溶液（标准溶液（0.1 mol/L 0.1 mol/L）；H H3 3BO3BO3溶液溶液(3%)(3%)；H H2 2SO4(SO4(浓浓)；NaOH NaOH溶液溶液(30-40%)(30-40%)；K K2 2SO4(SO4(固体固体)；CuSO4(CuSO4(固体固体)；甲基红甲基红溴甲酚绿混合指示剂。溴甲酚绿混合指示剂
4、。实验仪器：实验仪器：凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪；蒸馏单元及电位滴定仪；消化管，适用于凯氏定氮仪；消化管，适用于凯氏定氮仪；接收瓶，接收瓶，300ml300ml三角瓶或烧杯。三角瓶或烧杯。消化炉消化炉蒸馏单元及电位滴定仪实验步骤：实验步骤：1 1、样品的称取：、样品的称取：原料奶和纯牛奶：称取约原料奶和纯牛奶：称取约5g5g；乳饮料：称取约乳饮料：称取约8g8g；冰激凌：称取约冰激凌：称取约5g5g；乳粉：乳粉：称取约称取约0.5g0.5g；将上述样品用减量法称入消化管中。将上述样品用减量法称入消化管中。2 2、消化：、消化
5、：将样品称入消化管中，同时称取将样品称入消化管中，同时称取5g5g硫酸钾，硫硫酸钾，硫酸铜然后加入酸铜然后加入1520ml1520ml浓硫酸，将消化管放入消化浓硫酸，将消化管放入消化炉中，将温度旋钮设定在大约炉中，将温度旋钮设定在大约6 6档左右，连接好排档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化。气装置并打开开关，开始进行消化。注：注：决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定的实验室用仪器测量一个特定的样品所得到大量的实验室用仪器测量一个特定的样品所得到大量数据，一般选择一个高蛋白，高脂肪的牛奶样品，数据，一般选择一个高蛋白，高脂肪的牛奶样品，在透
6、明后用不同的沸腾时间（）测定它的蛋白含在透明后用不同的沸腾时间（）测定它的蛋白含量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加，逐渐量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加，逐渐趋于恒定，然后当沸腾时间更长含量反而降低。趋于恒定，然后当沸腾时间更长含量反而降低。选定能得到最大蛋白质的沸腾时间选定能得到最大蛋白质的沸腾时间。3 3、蒸馏：、蒸馏：把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中，在冷把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中，在冷凝器出口的下面放置一个接收瓶，还要把连接管放凝器出口的下面放置一个接收瓶，还要把连接管放到接收瓶底端，编辑蒸馏程序，设定硼酸到接收瓶底端，编辑蒸馏程序，设定硼酸50ml50ml，氢，氢氧化
7、钠氧化钠65ml65ml，蒸馏时间，蒸馏时间35min35min。注：注：蒸馏时间的确定蒸馏时间的确定4 4、滴定：、滴定：用用pHpH为和的缓冲溶液校准电位滴定仪。为和的缓冲溶液校准电位滴定仪。设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序，将滴定终设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序，将滴定终点设为点设为PHPH值，并开始滴定。值，并开始滴定。空白试验：空白试验：按照上述步骤进行空白试验，在消化管中加入按照上述步骤进行空白试验，在消化管中加入蔗蔗糖糖。5 5、结果表达、结果表达 ：（V-V0）c(H+)氮含量氮含量（)100 m其中：其中：V V 测定中消耗盐酸标准容液的体积，测定中消耗盐酸标准容液的体
8、积，mlml。V V0 0 空白试验中消耗盐酸标准容液的体积，空白试验中消耗盐酸标准容液的体积，mlml。c(Hc(H+)硫酸标准溶液硫酸标准溶液H H+的摩尔浓度，的摩尔浓度，mol/Lmol/L。mm样品质量，样品质量，g g。四舍六入的结果保留到四舍六入的结果保留到0.01%0.01%。蛋白质含量的计算，用质量百分数表达，用氮含量乘蛋白质含量的计算，用质量百分数表达，用氮含量乘以即可。以即可。（的含意（的含意)6 6、回收试验：、回收试验：方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行检查，按照上述步骤进行，检查，按照上述步骤进行，用硫酸铵（烘至恒重）加
9、蔗糖进行测定。回收率应用硫酸铵（烘至恒重）加蔗糖进行测定。回收率应大于大于9999。用色氨酸或盐酸赖氨酸，加蔗糖进行测定。回收率用色氨酸或盐酸赖氨酸，加蔗糖进行测定。回收率应大于应大于9898。回收率的计算：回收率的计算：用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量即可。用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量即可。注意事项注意事项 ：所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。样品中脂肪或糖含量较高时，消化过程中易产生样品中脂肪或糖含量较高时，消化过程中易产生大量的泡沫，可加入少量辛醇或液体石蜡或硅油大量的泡沫，可加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。消泡剂，并同时注意控制
10、热源强度。有机物完全分解，消化液呈兰色或浅绿色，但含有机物完全分解，消化液呈兰色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。蒸馏时保证溶液呈强碱性。蒸馏时保证溶液呈强碱性。硼酸吸收液的温度不能超过硼酸吸收液的温度不能超过4040，否则对氨的吸，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失。收作用减弱而造成损失。混合指示剂临用时混合，它在碱性溶液中呈绿混合指示剂临用时混合，它在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。因用硫酸滴定硼酸铵溶液，生成硫酸铵应为强因用硫酸滴定硼酸铵溶液，生成硫酸铵应为强酸弱碱盐，
11、所以溶液呈酸性，指示剂应显红色。酸弱碱盐，所以溶液呈酸性，指示剂应显红色。蛋白测定中，在催化剂中加入二氧化钛，消化蛋白测定中，在催化剂中加入二氧化钛，消化速度将会更快。能使难以氨化的组分快速氨化。速度将会更快。能使难以氨化的组分快速氨化。蒸馏时可加入锌粒，其作用相当于沸石，用量蒸馏时可加入锌粒，其作用相当于沸石，用量如绿豆大即可。如绿豆大即可。大量结晶体原因。大量结晶体原因。影响实验结果准确性的因数：影响实验结果准确性的因数：称样的准确性：称样的准确性：称样量的选择及称样量的准确度。称样量的选择及称样量的准确度。仪器的准确性：仪器的准确性：a)a)蛋白质偏高时，可能的原因：蛋白质偏高时，可能的
12、原因：是蒸馏时蒸汽太大，导致沸腾剧烈，将蒸馏液是蒸馏时蒸汽太大，导致沸腾剧烈，将蒸馏液喷入接收瓶中，蒸馏液中的氢氧化钠会消化一喷入接收瓶中，蒸馏液中的氢氧化钠会消化一定的硫酸标准溶液，致使结果偏高？定的硫酸标准溶液，致使结果偏高？滴定系统中有气泡滴定系统中有气泡?空白值？空白值？NaoHNaoH被污染？被污染？外部因素？外部因素？硫酸标准溶液硫酸标准溶液?b)b)蛋白质偏低时，原因可能是：蛋白质偏低时，原因可能是：消化时的温度太高，消化液喷出消化时的温度太高，消化液喷出？蒸馏过程中管路漏气？蒸馏过程中管路漏气？蒸馏开始后蒸馏开始后NaOHNaOH的量？的量？冷却水的效果？冷却水的效果？消化时间
13、？消化时间？消化温度？消化温度？硫酸加的量？硫酸加的量？混合指示剂？混合指示剂？硫酸的标定：硫酸的标定：需要注意以下几点：需要注意以下几点：无水碳酸钠必须烘至恒重，用基准试剂。无水碳酸钠必须烘至恒重，用基准试剂。最好不要将无水碳酸钠直接称入三角瓶中，以最好不要将无水碳酸钠直接称入三角瓶中，以免溶解不彻底。免溶解不彻底。混合指示剂临用时再配。混合指示剂临用时再配。滴定时速度不能太快，否则读数会偏高。滴定时速度不能太快，否则读数会偏高。配制及标定时执行依据配制及标定时执行依据配制及标定时执行依据配制及标定时执行依据(GB/T601)(GB/T601)(GB/T601)(GB/T601)称量质量称量
14、质量称量质量称量质量时时时时 精确至精确至精确至精确至时时时时 精确至精确至精确至精确至浓度值在标准浓度值的浓度值在标准浓度值的浓度值在标准浓度值的浓度值在标准浓度值的5%5%5%5%标定时需两人各做四次平行样标定时需两人各做四次平行样标定时需两人各做四次平行样标定时需两人各做四次平行样,误差要求按误差要求按误差要求按误差要求按 (GB/T601),(GB/T601),(GB/T601),(GB/T601),在运算过程保留五位有效数字在运算过程保留五位有效数字在运算过程保留五位有效数字在运算过程保留五位有效数字,结果取结果取结果取结果取四位四位四位四位.在常温下保存时间不超过两个月在常温下保存时间不超过两个月在常温下保存时间不超过两个月在常温下保存时间不超过两个月,出现混浊出现混浊出现混浊出现混浊,沉淀沉淀沉淀沉淀,颜色变化时应重新配制颜色变化时应重新配制颜色变化时应重新配制颜色变化时应重新配制.贮存容器不应与溶液反应贮存容器不应与溶液反应贮存容器不应与溶液反应贮存容器不应与溶液反应.