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1、关于离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶第一页，本课件共有18页一、实验目的和要求一、实验目的和要求1 1、学习离子交换层析的基本原理；、学习离子交换层析的基本原理；2 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。二、实验基本原理二、实验基本原理1 1、离子交换层析、离子交换层析 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合
2、物的反应主要以动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交离子交换方式换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用吸附作用进行。进行。这些过程都是这些过程都是可逆的可逆的。在某一。在某一pHpH值值的溶液中，不同的蛋白质所带的的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷电荷存在存在差异差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pHpH改变改变或者或者盐的离子强度逐渐盐的离子强度逐渐提高提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲
3、和力降低，不同的时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。第二页，本课件共有18页离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。基质基质电荷基团电荷基团反离子反离子阳离子交换剂阳离子交换剂电荷基团电荷基团反离子反离子阴离子交换剂阴离子交换剂电荷基团电荷基团反离子反离子基质基质基质基质溶液中的离子溶液中的离子或离子化合物或离子化合物溶液中的离子溶液中的离子或离子化合物或离子化合物可逆交换可逆交换可逆交换
4、可逆交换第三页，本课件共有18页第四页，本课件共有18页2 2、酶活力检测、酶活力检测(定性定性检测）检测）蔗糖酶（蔗糖酶（-D-D-呋喃型果糖苷呋喃型果糖苷-果糖水解酶果糖水解酶EC 3.2.1.26EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的催化非还原性双糖（蔗糖）的1,21,2糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖葡萄糖和和果糖果糖（还还原糖原糖）。）。因此，每水解因此，每水解1mol1mol蔗糖，就能生成蔗糖，就能生成2mol2mol还原糖。还原糖的测定有多种方还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用法，如采用3
5、.53.5二硝基水杨酸法，其原理是二硝基水杨酸法，其原理是3.53.5二硝基水杨酸与二硝基水杨酸与还原糖还原糖共热被还共热被还原成原成棕红色的氨基化合物棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.53.5二硝基二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。第五页，本课件共有18页三、实验材料与试剂三、
6、实验材料与试剂1 1、实验材料、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品蔗糖酶粗分离纯化样品2 2、实验试剂、实验试剂 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-Sepharose Fast Flow(弱碱性阴离子交换剂弱碱性阴离子交换剂)；20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；缓冲液；20mmol/L Tris-HCl20mmol/L Tris-HCl，（，（1mol/L NaCl1mol/L NaCl）pH7.3pH7.3缓冲液缓冲液(学生自配）；学生自配）；0.2mol/L0.2mol/L乙酸缓冲液，乙酸缓冲液，p
7、H4.5 pH4.5；5%5%蔗糖溶液蔗糖溶液 ；3 3，5-5-二硝基水杨酸试剂二硝基水杨酸试剂 甲液：溶解甲液：溶解6.9g 6.9g 结晶酚于结晶酚于15.2ml 1015.2ml 10NaOHNaOH溶液中，并用水稀释至溶液中，并用水稀释至69ml,69ml,在此溶液中在此溶液中加加6.9g6.9g亚硫酸氢钠。亚硫酸氢钠。乙液：称取乙液：称取255255克酒石酸钾钠加到克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH300ml 10%NaOH溶液中，再加入溶液中，再加入800ml 1%3,5-800ml 1%3,5-二二硝基水杨酸溶液硝基水杨酸溶液.甲甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂乙二溶液相
8、混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用贮于棕色瓶中备用,在室温放置在室温放置7-107-10天以后天以后使用。使用。第六页，本课件共有18页四、实验器材与仪器四、实验器材与仪器1 1、高速冷冻离心机；、高速冷冻离心机；2 2、层析柱（、层析柱（1.0201.020 ）(1(1支支/组）；组）；3 3、恒流泵（流速、恒流泵（流速0.80.81ml/min1ml/min）(10rpm)(10rpm)（1 1台台/组）；组）；4 4、梯度混合器、梯度混合器(100ml(100ml梯度杯梯度杯)（1 1套套/组）；组）；5 5、核酸蛋白检测仪（灵敏度、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A0.5A）（）（1 1台
9、台/组）组）；6 6、记录仪（纸速：、记录仪（纸速：0.5mm/min0.5mm/min；灵敏度：；灵敏度：50mV50mV）（）（1 1台台/组）组）；7 7、部分收集器及收集试管（、部分收集器及收集试管（4ml/4ml/管）（管）（1 1台台/组）组）；8 8、铁架台、夹子、铁架台、夹子 （固定层析柱用）（固定层析柱用）（1 1套套/组）组）；9 9、2020冰箱（保存样品用）；冰箱（保存样品用）；1010、微量移液枪微量移液枪 200ul200ul、1000ul1000ul；1111、1.5ml1.5ml离心管（留样品离心管（留样品和样品和样品用）；用）；1212、7ml7ml离心管（留
10、样品离心管（留样品用）用）；1313、恒温水浴（、恒温水浴（100100）；）；1414、试管、移液管、试管架等。、试管、移液管、试管架等。第七页，本课件共有18页五、实验操作方法和步骤五、实验操作方法和步骤1 1、离子交换剂准备：、离子交换剂准备：DEAESephadexDEAESephadex，取适量取适量DEAESephadexDEAESephadex，加入，加入0.5mol/L NaOH0.5mol/L NaOH溶液，轻轻溶液，轻轻搅拌，浸泡搅拌，浸泡0.50.5小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中
11、，加放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl,50ml 0.5 mol/L HCl,搅匀，浸泡搅匀，浸泡0.50.5小时，同上，用去离小时，同上，用去离子水洗至近中性，（子水洗至近中性，（DEAE-Sepharose Fast FlowDEAE-Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。浸入，用后务必回收）。浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。缓冲液中平衡备用。DEAE-Sepharose Fast FlowDEAE-Sepharose Fast Flow，（按说明书处理）按说明书处理
12、）第八页，本课件共有18页2 2、样品处理：、样品处理：将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解充分溶解于于15ml15ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；缓冲液；4 15000r/min,4 15000r/min,离心离心1010分钟，收集样品上清液（样品分钟，收集样品上清液（样品）测量总体积）测量总体积(ml(ml数），数），留取留取1ml1ml（样品（样品）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS-SDS-PAGEPAGE分析分析；
13、将其余样品（样品；将其余样品（样品）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可可先取先取50ul50ul酶液做酶活力检测）。酶液做酶活力检测）。3 3、纯化检测仪器连接：、纯化检测仪器连接：将梯度混合器将梯度混合器(100ml(100ml梯度杯梯度杯)，层析柱（，层析柱（1.0201.020 ），恒流泵），恒流泵(10rpm)(10rpm)（流速（流速0.80.81ml/min1ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A0.5A），记录仪（纸速：），记录仪（纸速：0.5mm/min0.5mm/min，50mV50mV）、部分收集
14、器（）、部分收集器（4 45 ml/5 ml/管管/5min/5min）等按下图连接并设置好。）等按下图连接并设置好。第九页，本课件共有18页 211 1、50ml 20mmol/L Tris-HCl50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3pH7.3缓冲液缓冲液2 2、50ml 20mmol/L Tris-HCl50ml 20mmol/L Tris-HCl，（，（1mol/L NaCl1mol/L NaCl）pH7.3pH7.3缓冲液缓冲液梯度混合器梯度混合器层析柱层析柱（1.0201.020 ）恒流泵恒流泵核酸蛋白检测仪核酸蛋白检测仪记录仪记录仪部分收集器部分收集器DEAE-
15、Sepharose Fast FlowDEAE-Sepharose Fast Flow纯化检测仪器连接示意图纯化检测仪器连接示意图第十页，本课件共有18页4 4、装柱、装柱(层析柱规格层析柱规格120cm)120cm)、平衡、平衡 ：装柱前先调好流速装柱前先调好流速0.8ml0.8ml1ml/min1ml/min，然后将柱下端的出水口关闭，加进，然后将柱下端的出水口关闭，加进5ml5ml（约（约1/31/3柱床柱床体积）体积）20 mmol/L Tris-HCl 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3pH7.3的缓冲液，然后将处理好的的缓冲液，然后将处理好的DEAESepharose
16、 Fast DEAESepharose Fast FlowFlow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至续加进柱内至层析柱上端层析柱上端。注意不能带进气泡，待凝胶。注意不能带进气泡，待凝胶自然自然沉积离沉积离柱管上端柱管上端约约1-2cm1-2cm后后松开层析柱出口，控制流速松开层析柱出口，控制流速 0.8ml 0.8ml1ml/min1ml/min；待柱内；待柱内DEAE Sepharose Fast DEAE Sepharose Fast Flow Flow 凝胶沉
17、降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的再补加处理好的DEAESepharose Fast FlowDEAESepharose Fast Flow凝胶，直到凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度凝胶沉降至稳定高度距层距层析柱上端约析柱上端约3cm3cm处为止（这时须保持处为止（这时须保持DEAESepharose Fast FlowDEAESepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。用凝胶柱面平整）。用20 20 mmol/L Tris-HClmmol/L Tris-HCl、pH7.3pH7.3的缓
18、冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pHpH一致。一致。5 5、加样：、加样：停止加入停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作恒流泵停止工作。用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品。用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品）加入层析柱）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进
19、入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入的样品洗下，并完全进入胶体后，胶体后，再再加洗脱缓冲液至一定高度加洗脱缓冲液至一定高度。第十一页，本课件共有18页6 6、洗脱：、洗脱：方法方法11梯度洗脱法：梯度洗脱法：加样后，用加样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml0.8ml1ml/min1ml/min，洗去未被，洗去未被DEAE Sepharose F
20、ast FlowDEAE Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液缓冲液NaClNaCl梯度洗脱（浓度为梯度洗脱（浓度为0-1mol/L NaCl 0-1mol/L NaCl），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.30.05mol/L Tris-HCl pH
21、7.3缓冲液和缓冲液和50ml50ml含含1mol/L NaCl1mol/L NaCl的的0.05ml/L Tris-HCl 0.05ml/L Tris-HCl pH7.3pH7.3缓冲液。洗脱流速为缓冲液。洗脱流速为0.80.81ml/min1ml/min，每，每4ml4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，止。跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总测量总体积（体积（mlml数）（样品数）（样品），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定、），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶
22、活力测定、SDS-SDS-PAGEPAGE分析、分析、酶的基本性质实验酶的基本性质实验和用于和用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验）（半自主性设计实验），样品低温样品低温2020保存。保存。第十二页，本课件共有18页方法方法2 2、一步洗脱法：、一步洗脱法：上样后，上样后，用用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml0.8ml1ml/min1ml/min，洗去，洗去DEAEDEAESepharose Fast F
23、lowSepharose Fast Flow未吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核未吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。用酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。用0.15mol/LNaCl 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 0.15mol/LNaCl 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲缓冲液继续洗脱被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脱流速为液继续洗脱被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脱流速为0.8ml0.8ml1ml/min1ml/min，4ml/4ml/管管/5min/5min，直，直至待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。测定各接收管的蔗糖酶至待层析柱流出液
24、在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。测定各接收管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出总体积（活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出总体积（mlml数）（样品数）（样品），并），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGESDS-PAGE分析以及用于分析以及用于“用正交法用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验），样品低温（半自主性设计实验），样品低温2020保保存。存。第十三页，本课件共有18页7 7、蔗糖酶活力检测、蔗糖酶活力检测空白对照空白对照 样品管样品管0.2m
25、ol/L0.2mol/L乙酸缓冲液，乙酸缓冲液，pH4.5pH4.50.5ml0.5ml0.5ml0.5ml5%5%蔗糖溶液蔗糖溶液0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml蒸馏水蒸馏水1.0ml1.0ml0.9ml0.9ml分离纯化样品溶液分离纯化样品溶液/0.1ml0.1ml 5050水浴水浴10min 10min 3.53.5二硝基水杨酸试剂二硝基水杨酸试剂 1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml 100100水浴水浴5min 5min 蒸馏水蒸馏水5ml5ml5ml5ml观察颜色观察颜色 收集活力高的蔗糖酶液，测量总体积收集活力高的蔗糖酶液，测量总体积(ml(ml数数)（样品（样品），
26、），-20-20保存，保存，用于蔗糖酶用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGESDS-PAGE分析以及用于用正交法测定几种因素对分析以及用于用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响（限定性设计实验）。蔗糖酶活性的影响（限定性设计实验）。样品低温样品低温2020保存。保存。第十四页，本课件共有18页六、结果分析讨论六、结果分析讨论注意事项 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液 面在树脂表面以下等现象发生。第十五页，本课件共有18页下下 次次 实实 验验实验三实验三 蔗糖蔗糖酶酶蛋白蛋白含量的测定含量的测定Folin-Folin-酚法酚法实验四实验四 蔗糖酶活力测定蔗糖酶活力测定3.53.5二硝基水杨酸法二硝基水杨酸法第十六页，本课件共有18页值值 日日第十七页，本课件共有18页2022/12/11感谢大家观看第十八页，本课件共有18页