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1、 第十三章第十三章 DNA芯片技术芯片技术第一节第一节 概概 述述一、一、DNA芯片技术的概念芯片技术的概念1DNA芯片技术芯片技术 DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成（芯片技术是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探针，或者直接将大量的）寡核苷酸探针，或者直接将大量的DNA探针以显探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息（基交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支
2、持因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为物，所以称为DNA芯片。芯片。DNA芯片又被称为基因芯片（芯片又被称为基因芯片（gene chips）、）、DNA阵列（阵列（DNA array）、）、cDNA芯片（芯片（cDNA chips）、寡核苷酸阵列（）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）等。）等。2生物芯片的概念及其种类和作用。生物芯片的概念及其种类和作用。生物芯片（生物芯片（biochip）是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构）是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、建的微型生物化学分析系统，以实现对
3、细胞、DNA、蛋白质及其他生、蛋白质及其他生物组分的快速、敏感、高效的处理。生物芯片可以分为物组分的快速、敏感、高效的处理。生物芯片可以分为DNA芯片、蛋芯片、蛋白质芯片和其他芯片三类。其中前两者属于检测芯片：白质芯片和其他芯片三类。其中前两者属于检测芯片：（1）DNA芯片可以通过杂交来检测样品中的核酸，也可以利用双链芯片可以通过杂交来检测样品中的核酸，也可以利用双链DNA与蛋白质的相互作用来检测蛋白质。与蛋白质的相互作用来检测蛋白质。（2）蛋白质芯片利用蛋白质间的相互作用如抗原）蛋白质芯片利用蛋白质间的相互作用如抗原-抗体反应或受体抗体反应或受体-配配体之间的特异作用来进行检测。体之间的特异
4、作用来进行检测。（3）其他的生物芯片有样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛细管电泳芯）其他的生物芯片有样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛细管电泳芯片等，即在芯片上分别进行样品的分离、扩增、生化反应等过程。片等，即在芯片上分别进行样品的分离、扩增、生化反应等过程。3广义的生物芯片概念。广义的生物芯片概念。广义的生物芯片概念还包括缩微实验室，广义的生物芯片概念还包括缩微实验室，即通过采用类似集成电即通过采用类似集成电路制作过程中的半导体光刻加工的缩微技术，把生命科学研究中某些路制作过程中的半导体光刻加工的缩微技术，把生命科学研究中某些不连续的过程如样品的分离，扩增，生化反应和检测全部集成到芯片不连续的过程如
5、样品的分离，扩增，生化反应和检测全部集成到芯片上，使其连续化和微型化，构成所谓的缩微芯片实验室（上，使其连续化和微型化，构成所谓的缩微芯片实验室（laboratory on a chip，microlab）。这与）。这与xx将数间房屋大小的计算机缩微成现将数间房屋大小的计算机缩微成现在的笔记本式计算机有异曲同工之妙。在的笔记本式计算机有异曲同工之妙。二、二、DNA芯片的主要类型及其特点。芯片的主要类型及其特点。根据根据DNA芯片的制备方式可以将其分为两大类：芯片的制备方式可以将其分为两大类：原位合成芯片（原位合成芯片（synthetic gene chip）采用显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位
6、原位合成寡核苷酸而制采用显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。这种芯片的集成度教高，可达成的芯片称为原位合成芯片。这种芯片的集成度教高，可达10万万40万点阵万点阵/平方厘米。但合成的寡核苷酸探针长度较短，一般为平方厘米。但合成的寡核苷酸探针长度较短，一般为820个个核苷酸残基（核苷酸残基（nucleotide，nt），最长为），最长为50nt，因此需要使用多个相，因此需要使用多个相互重叠的探针片进行检测，才能对基因进行准确的鉴定。互重叠的探针片进行检测，才能对基因进行准确的鉴定。DNA微集芯片（微集芯片（DNA microchips）将预先制备的将预先
7、制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片称为面而制成的芯片称为DNA微集芯片，又称为微集芯片，又称为DNA微集陈列（微集陈列（DNA microarray）。这类芯片集成度相对较低，可达）。这类芯片集成度相对较低，可达1万万10万点阵万点阵/平方平方厘米，但使用的探针组的来源比较灵活，可以是合成的寡核苷酸短片厘米，但使用的探针组的来源比较灵活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用来自基因组的较长的段，也可以是采用来自基因组的较长的DNA片段；可以是双链，也可片段；可以是双链，也可以采用单链的以采用单链的DNA或或RNA片段，
8、且技术实现未受到严格的专利控制，片段，且技术实现未受到严格的专利控制，因而近年来发展很快。探针的长度可达因而近年来发展很快。探针的长度可达100500nt。第二节第二节 DNA芯片技术的基本原理与方法芯片技术的基本原理与方法一、芯片的制备一、芯片的制备 芯片制备的基本原理。芯片制备的基本原理。芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备和芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备和DNA微集微集陈列的制备三个方面。陈列的制备三个方面。1.支持物的预处理支持物的预处理 目前用于目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分为两类：实性材料和芯片制作的固相支持物大致可分为两类：实性材料和膜性
9、材料。膜性材料。实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出尼龙膜、硝酸纤维素膜等。实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团。在合成寡核苷酸前，这些基因可与光敏材料的羟基、氨基等活性基团。在合成寡核苷酸前，这些基因可与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来，合成时在光照下除去光敏保光敏保护基团形成共价交联而被保护起来，合成时在光照下除去光敏保护基团，该活性基团又可以和活化的单核苷酸发生化学反应。另一方面，护基团，该活性基团又可以和活化的单核苷酸
10、发生化学反应。另一方面，这些活性基团可与这些活性基团可与DNA分子中的羟基等基团形成共价结合而使打印在上分子中的羟基等基团形成共价结合而使打印在上面的面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷吸附带负电荷的或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷吸附带负电荷的DNA探针。探针。2.原位合成芯片的制备原位合成芯片的制备 原位合成芯片是采用显微光蚀刻原位合成芯片是采用显微光蚀刻（photolithography）技术或压电打印技术或压电打印（piezoelectric printing）技术，在芯片的特
11、定区域原位合成寡核苷酸而技术，在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制成。制成。显微光蚀刻技术也称为光引导聚合技术（显微光蚀刻技术也称为光引导聚合技术（light-directed synthesis），它不仅可用于寡核苷酸的合成，），它不仅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技术也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技术（photolithography）与传统的核酸，多肽固相合成技术）与传统的核酸，多肽固相合成技术相结合的产物，是原位合成芯片的主要方法。压电打印法相结合的产物，是原位合成芯片的主要方法。压电打印法的装置与普通的彩色喷墨打印机相似，所用的技术也是常的装置与
12、普通的彩色喷墨打印机相似，所用的技术也是常规的固相合成方法。规的固相合成方法。3.DNA微集陈列的制备微集陈列的制备 DNA微集陈列的制备采用的是预先合成微集陈列的制备采用的是预先合成DNA或制备基或制备基因探针然后打印到芯片上的方式。因探针然后打印到芯片上的方式。二、样品的准备二、样品的准备 样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记等过程。样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记等过程。1样品的分离纯化样品的分离纯化 主要从活组织或血液中获得主要从活组织或血液中获得DNA或或mRNA，这个过程包括细胞分，这个过程包括细胞分离，破裂，去蛋白，提取及纯化核酸的过程。离，破裂，去蛋白，提取及纯化核
13、酸的过程。2样品的扩增样品的扩增 测定时往往需要较多的样品分子，因此对于分离获得的基因组测定时往往需要较多的样品分子，因此对于分离获得的基因组DNA通过通过PCR技术直接扩增，对于技术直接扩增，对于mRNA则需要逆转录，制备则需要逆转录，制备cDNA。3.样品的标记样品的标记 标记物主要有荧光分子（标记物主要有荧光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素）、生物素以及放射性同位素等。等。带有标记的带有标记的dNTP（cy3或或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素、生物素-dNTP）通过）通过DNA或或cDNA扩增的过程，掺入靶分子序列。也可以在扩增的过程，掺入靶分子序列。也可以在制
14、备引物时，掺入标记的核苷酸，扩增靶序列后，使扩增产物末端带制备引物时，掺入标记的核苷酸，扩增靶序列后，使扩增产物末端带有标记物。膜性载体可以用于检测同位素标记的样品。有标记物。膜性载体可以用于检测同位素标记的样品。样品分子标记的质量影响芯片检测的灵敏度，因此，核酸的提取，样品分子标记的质量影响芯片检测的灵敏度，因此，核酸的提取，反转录以及标记等各环节要求严格操作。反转录以及标记等各环节要求严格操作。荧光标记分辨率高于同位素荧光标记分辨率高于同位素标记，而且可以采用双色，如对照样品标红色，待检样品标绿色，有标记，而且可以采用双色，如对照样品标红色，待检样品标绿色，有助于结果分析与判断。助于结果分
15、析与判断。三、分子杂交三、分子杂交 芯片杂交是应用标记的待测样品（靶序列）与固定在载体表面的芯片杂交是应用标记的待测样品（靶序列）与固定在载体表面的探针进行的复杂过程。探针进行的复杂过程。依据探针长度、类型以及不同的目的，确定温度、盐浓度与反应依据探针长度、类型以及不同的目的，确定温度、盐浓度与反应时间。通常采用的条件是：时间。通常采用的条件是：42，50%甲酰胺，甲酰胺，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt试剂。也可采用试剂。也可采用65，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt试剂或者试剂或者65，10%SDS，7%PEG-800。杂交过程类似杂交过程类似Northern或或S
16、outhern杂交，如封闭液预杂交、杂交、杂交，如封闭液预杂交、杂交、清洗、干燥与检测。清洗、干燥与检测。四、检测分析四、检测分析 芯片杂交信号的检测可应用荧光检测法、质谱法、化学发光法、芯片杂交信号的检测可应用荧光检测法、质谱法、化学发光法、光导纤维法以及生物传感器法。光导纤维法以及生物传感器法。其中激光共聚焦荧光检测法是最常应其中激光共聚焦荧光检测法是最常应用的方法：激光从芯片的背面切入，聚焦于芯片与靶溶液的相互作用用的方法：激光从芯片的背面切入，聚焦于芯片与靶溶液的相互作用面，与探针杂交的靶序列标记物被激发产生荧光，经过棱镜聚焦而被面，与探针杂交的靶序列标记物被激发产生荧光，经过棱镜聚焦
17、而被检测器检测。样品靶序列与探针严格配对杂交的分子发生强荧光信号，检测器检测。样品靶序列与探针严格配对杂交的分子发生强荧光信号，不完全杂交显示较弱的信号。不完全杂交显示较弱的信号。第三节第三节 DNA芯片技术的应用芯片技术的应用 DNA芯片使用的基本流程。芯片使用的基本流程。DNA芯片使用包括待测样品准备、分子杂交和检测分析芯片使用包括待测样品准备、分子杂交和检测分析3个步骤。个步骤。1.待测样品的准备待测样品的准备 样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记。样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记。首先采用常规方法从组织细胞中分离纯化样品核酸、首先采用常规方法从组织细胞中分离纯化样品核酸、D
18、NA或或mRNA，由于目，由于目前芯片检测仪器的灵敏度有限，要求对样品中靶序列进行高效而特异地扩增。前芯片检测仪器的灵敏度有限，要求对样品中靶序列进行高效而特异地扩增。样品的标记主要采用荧光法，也可以用生物素，放射性核素标记法。样品的标记主要采用荧光法，也可以用生物素，放射性核素标记法。2.分子杂交分子杂交 待测样品经扩增和标记处理后，即可与待测样品经扩增和标记处理后，即可与DNA芯片上的探针陈列进行分子杂芯片上的探针陈列进行分子杂交。交。芯片杂交与传统的芯片杂交与传统的Southern印迹等杂交方法类似，属固印迹等杂交方法类似，属固-液杂交。探针液杂交。探针分子固定于芯片表面，与位于液相的靶
19、分子进行反应。芯片杂交的特点是探分子固定于芯片表面，与位于液相的靶分子进行反应。芯片杂交的特点是探针的量显著大于靶基因片段，杂交动力学呈线形关系。杂交信号的强弱与样针的量显著大于靶基因片段，杂交动力学呈线形关系。杂交信号的强弱与样品中靶基因的量成正相关。品中靶基因的量成正相关。3.检测分析检测分析 芯片杂交及清洗后，未杂交分子被清除，带有荧光标记的靶芯片杂交及清洗后，未杂交分子被清除，带有荧光标记的靶DNA（杂交分（杂交分子）与其互补的子）与其互补的DNA探针形成杂交体，在激光的激发下，荧光素发射荧光。探针形成杂交体，在激光的激发下，荧光素发射荧光。以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上
20、以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上DNA探针的原始序列将靶探针的原始序列将靶DNA的信息反映出来。的信息反映出来。DNA芯片技术在医学领域的应用芯片技术在医学领域的应用 DNA芯片用于基因诊断、芯片用于基因诊断、DNA序列测定、临床药物筛选、法医鉴定、序列测定、临床药物筛选、法医鉴定、食食品工业和环境监测等方面。在医学领域具有极大的潜力。品工业和环境监测等方面。在医学领域具有极大的潜力。1.基因诊断基因诊断 应用应用DNA芯片技术可以在芯片技术可以在DNA水平检测与疾病相关的内源性或外源性基水平检测与疾病相关的内源性或外源性基因；应用表达芯片可以在因；应用表达芯片可以在mRNA水平分
21、析同一组织在不同的发育阶段，正常水平分析同一组织在不同的发育阶段，正常及病理状态基因表达的差异，也可以分析不同组织同一基因在正常及病理状及病理状态基因表达的差异，也可以分析不同组织同一基因在正常及病理状态下表达的差异，从而为疾病诊断与分类，病原微生物分型提供科学依据。态下表达的差异，从而为疾病诊断与分类，病原微生物分型提供科学依据。2.DNA序列测定序列测定 任何线状的单链任何线状的单链DNA或或RNA序列均可被分解成一系列碱基数固定、错落序列均可被分解成一系列碱基数固定、错落而且重叠的寡核苷酸，如而且重叠的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成分解成GTACTAGA、TACTCGAA、A
22、CTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五个错开五个错开1个碱基个碱基但是可重叠但是可重叠7个碱基的个碱基的8体亚序列，当然也可以分解成体亚序列，当然也可以分解成7体，体，9体或其他整数体或其他整数（n体）亚序列。如果用某种方法将体）亚序列。如果用某种方法将5个亚序列全部测定出来，就可以重新组个亚序列全部测定出来，就可以重新组建原来的核苷酸排列顺序。应用这一原理，可以合成或应用已知序列的所有建原来的核苷酸排列顺序。应用这一原理，可以合成或应用已知序列的所有可能的可能的n体寡核苷酸，并将其固定在芯片表面，然后与标记的待测靶序列杂交，体寡核苷酸，并将其固定在芯片表面，然后与标记的待测靶序
23、列杂交，经过重新组合，即可得到待测的经过重新组合，即可得到待测的DNA序列。序列。3.临床药物筛选临床药物筛选 临床许多细菌对药物具有抗药性，但是不同的亚型对同一药物的敏感性不临床许多细菌对药物具有抗药性，但是不同的亚型对同一药物的敏感性不同。同。DNA芯片技术已被用于鉴定结核菌及非典型分支杆菌的基因型与耐利福芯片技术已被用于鉴定结核菌及非典型分支杆菌的基因型与耐利福平的相关性以及平的相关性以及HIV产生抗药性与其逆转录酶及蛋白酶基因突变的相关性。这产生抗药性与其逆转录酶及蛋白酶基因突变的相关性。这为临床选择敏感药物提供了有效手段。为临床选择敏感药物提供了有效手段。4.其他领域其他领域 法医鉴定、食品工业、环境监测等方面，法医鉴定、食品工业、环境监测等方面，DNA芯片技术也将具有极大的潜芯片技术也将具有极大的潜力。力。