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1、细胞凋亡的分子机制第1页，本讲稿共16页细胞凋亡从形态学上看从细胞功能上看第2页，本讲稿共16页 细胞凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)是指在一定的条件下,细胞遵循固定的程序,自己结束生命的过程。从细胞功能上看,一个多细胞生物体中,在正常条件下,某些细胞的死亡是细胞个体发育的一个阶段(最后阶段的正常个体发育过程,称之为程序性死亡(PCD)。从形态上看,上述细胞死亡有其特定的形态学变化,染色质浓缩和DNA降解等等;)。这种死亡是一种预定的、并受到严格程序控制例如细胞产生膜泡、具有上述形态学特点的细胞死亡称之为凋亡。由于在绝大多数情况下
2、,程序性死亡具有与凋亡相同的形态学变化,因此,这两个概念或名词可以看成是从不同角度描述的同一过程,可以混用。第3页，本讲稿共16页 从形态学上看(图 1),细胞凋亡是一变化的过程。首先细胞变圆,随即与周围细胞脱离;细胞失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高,凝聚在核膜周边;然后核染色质断裂为大小不等的片段,与某些细胞器如线粒体聚集在一起,被反折的细胞膜包围。从外观上看,细胞表面产生了许多泡状或芽状突起;接着这些突起逐渐分隔,形成单个的凋亡小体(apoptotic body);最后凋亡小体被邻近的正常细胞吞噬并消化。细胞凋亡过程中有一些标志性的生物化学变化 :细胞
3、膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)由膜内侧面翻到外侧面;胞质内蛋白酶活化,发生级联反应(cascade),同时有能量消耗、新基因转录或蛋白质合成等变化;细胞核内染色质 DNA被核酸酶酶切成以核小体180200bp为重复单位的片段,如果将从凋亡细胞中提取的 DNA进行琼脂糖凝胶电泳,会形成梯状的 DNA条带(DNA ladder)。PS:磷脂酸与丝氨酸酯化生成的化合物。是血小板膜带负电荷的酸性磷脂(即血小板第三因子)。当血小板因组织受损而被激活时，其膜的这些磷脂转向外侧，作为表面催化制与其他凝血因子一起导致凝血酶原的活化。Cascade:细胞内信号传递途径关联蛋白质的系列反应，即通过多次的逐级放大使较弱
4、的输入信号转变为极强的输出信号，导致各种生理响应的过程。一般包括磷酸化和去磷酸化反应。第4页，本讲稿共16页 从细胞功能上看,细胞凋亡对多细胞生物体具有重要的意义。一方面在生物发育过程中细胞凋亡可以清除没有功能的、不需要的、不正常的和有害的细胞,优化组织器官的结构和细胞数目,确保正常个体发育。另一方面在生物体整个生命过程中,每天都会产生许多功能异常的细胞,如癌变细胞、衰老细胞、被微生物侵袭的细胞等。细胞凋亡可以将这些细胞清除,并且由新诞生的功能正常的细胞替换。因此,体内细胞的诞生和死亡处于动态平衡,从而维持机体组织器官中细胞数量稳定和功能正常。第5页，本讲稿共16页早在 1896年科学家就已经
5、在鱼类神经元的发育过程中观察到细胞凋亡的现象,细胞凋亡的概念最早是由英国阿伯丁大学的病理学家科尔(Kerr)提出的,同时他还详尽描述了死亡过程中细胞的形态学变化。进入 20世纪 60年代后,细胞凋亡的研究进入到基因水平,先后有三位科学家,即美国加州伯克莱科学研究所的悉尼布雷内(1927年出生)、英国剑桥桑格(Sanger)研究中心的约翰苏尔斯顿(1942年出生)和美国麻省理工学院的罗伯特霍维茨(1947年出生)(图 2),他们用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)作为动物模型做了开创性的工作,为此共同获得了2002年诺贝尔生理或医学奖。公报称,由于他
6、们发现了器官发育的基因调控和细胞的程序性死亡(genetic regulation of organ development and programmed cell death)而获奖。第6页，本讲稿共16页凋亡基本的分子机制及其发现凋亡基本的分子机制及其发现C.elegans细胞凋亡的分子机制ydneyBrenner将C.elegans作为模型动物为凋亡研究提供绝好材料John E.Sulston完成C.elegans细胞谱系绘制,使研究凋亡分子机制成为可能H.RobertHorvitz对凋亡分子机制的阐明 第7页，本讲稿共16页第8页，本讲稿共16页基本的分子机制C.elegans的细胞凋
7、亡过程比较简单,现已鉴定并得到确认的是共有四个基因编码的蛋白质参与了凋亡过程,它们分别具有抑制、启动或产生效应的作用,包括egl-1、ced-3,ced-4和ced-9。Ced-9(cell death abnormal)与哺乳动物Bcl-2蛋白家族中的Bcl-2蛋白(见后述)在结构和功能上同源,具有抑制凋亡启动的作用。Egl-1(egg laying defective)与Bcl-2蛋白家族中的唯BH3域蛋白(BH3-only p roteins)同源(见后述),具有启动凋亡的作用。ced-4与哺乳动物的衔接蛋白apaf-1(见后述)同源,具有推动凋亡进程的作用。而ced-3则与哺乳动物胱天
8、蛋白酶蛋白家族(caspases)同源(见后述),具有执行凋亡的作用,使细胞表现出典型的凋亡形态变化。C.elegans的凋亡信号通路如图3所示。在正常细胞中,ced-9结合在线粒体膜上,并且与ced-4牢固结合形成复合体而抑制ced-4的功能。当细胞接收到凋亡信号后,egl-1蛋白开始高表达,它直接与ced-9结合,而使ced-4与ced-9脱离进入胞浆;而后ced-4与ced-3结合形成ced-3/ced-4蛋白复合体并移向核膜,同时ced-4与ced-3的结合使得ced-3在局部的浓度升高,有助于ced-3聚合和自我活化;最后被活化的ced-3催化水解细胞中的各种底物,使细胞表现出典型的
9、凋亡形态变化。C.elegans的凋亡信号通路看似简单,然而它的发现却是由三位科学家前后30年承前启后的艰辛工作才得以完成,以下就三位科学家30年来的研究历程作一简要回顾。第9页，本讲稿共16页第10页，本讲稿共16页悉尼悉尼布雷内布雷内将C.elegans作为模型动物为凋亡研究提供绝好材料材料1974年,悉尼悉尼布雷内布雷内发表了他学术生涯中第一篇重要论文“The genetics of Caenorhabditis elegans”,在这篇文章中,他报道了用C.elegans作为模型动物考察基因对神经系统的分化发育以及对生物行为调控的分子机制。悉尼布雷内指出C.elegans作为模型动物有
10、诸多的优点:(1)自然存在的C.elegans有自我受精的雌雄共体(hermaphrodite)和雄性体(male)两种形态,其中雌雄共体细胞核内有5对常染色体和一对性染色体XX,雄性体有5对常染色体和一条性染色体X,这对于杂交实验进行基因定位很有利;(2)C.elegans成虫体长1毫米,便于显微镜观察;(3)C.elegans在20条件下生活周期为3.5天,从受精卵发育为成虫经历L14共四个阶段,在琼脂糖培养基上以大肠杆菌(E.coli)喂养可以使其大量生长繁殖,这样就可以在较短时间里获得大量不同表型的动物以供研究。B renner用乙基甲烷磺酸盐(Ethyl methanesulphon
11、ate,EMS)做突变剂筛检出了约300种与C.elegans形态和行为有关的突变体,涉及约100个不同的基因。同年Brenner还与John E.Sulston合作对C.elegans的DNA做了测定.第11页，本讲稿共16页约翰苏尔斯顿 完成C.elegans细胞谱系绘制,使研究凋亡分子机制成为可能C.elegans胚后发育阶段细胞谱系的绘制C.elegans胚胎发育阶段的细胞谱系绘制第12页，本讲稿共16页此后,Sulston将主要的研究精力转到对C.ele2gans细胞谱系的研究上。他利用当时B renner实验室现有的微分干涉差显微镜观察幼虫的发育,绘制胚后发育的细胞图谱。由于需要观
12、察幼虫的动态变化过程,不能将其处死做成压片,而应保证其活力状态,然而活动的幼虫势必到处游走,给观察带来了巨大的麻烦。于是Sulston改进制片的方法,他先在载玻片涂上一层极薄而又平整的琼脂糖,将幼虫置于其上,再在盖玻片的下面抹上大肠杆菌后盖在琼脂糖层上,这样幼虫就可以在琼脂糖层与盖玻片之间的狭小空间里自由蠕动,既保持了其活性状态,又便于显微镜下的观察及作图。由于观察方法的改进,加之Sulston极其耐心和严谨的科学态度,使得研究的进程大大加快。第13页，本讲稿共16页12个命运细胞例如,C.elegans雌雄共体发育进入L1中期时在腹部神经索的位置上共产生12个前体细胞P1P12,在之后的胚后
13、发育过程中,这12个细胞将发育为腹部神经索及相关的神经节。在L1期,12个细胞每个都按相同的模式分裂产生5个神经元和1个皮下细胞,接近分裂完成时有9个固定的细胞发生程序性死亡。进入发育的L3期后,由P3P8分裂而来的皮下细胞互相靠拢发育为雌雄共体的性腺,其中由P5、6、7分裂而来的三个皮下细胞经过一系列的细胞分裂最终产生22个细胞构成阴门,而由P3、4、8分裂而来的三个皮下细胞的子代细胞则成为神经皮下细胞,在成虫这些细胞位于皮下合胞体内(图4)。Sulston在他的研究论文中还详细描述了发生凋亡细胞的形态学改变:细胞发生凋亡的最早表现是其折光性略有增加,接着胞核的折光性增加直至成为类似扁平纽扣
14、样的形态,最后胞核折光性减弱,皱缩并最终消失,整个过程在1小时内完成。Sulston早年在英国剑桥大学医学研究委员会分子生物学实验室完成的C.elegans细胞谱系的绘制工作,尤其是131个凋亡细胞的确认为研究凋亡的分子机制奠定了坚实的基础,也使他赢得了2002年诺贝尔生理学或医学奖。第14页，本讲稿共16页罗伯特霍维茨对凋亡分子机制的阐明在此期间,另一位科学家Hedgecock发现了C.elegans另外两个与凋亡相关的突变基因ced-1和ced-2。在正常情况下,凋亡的细胞会被周围正常的细胞吞噬清除,显微镜下很难及时观察并记录到;而有ced-1或ced-2基因功能缺失突变的凋亡细胞则可以长时间存在而不被吞噬清除,如此就可以作精确的凋亡细胞部位和数目的纪录。第15页，本讲稿共16页第16页，本讲稿共16页