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1、实验十三细胞凋亡的检测第1页，本讲稿共19页 实验目的实验目的细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测了解细胞凋亡的检测方法了解细胞凋亡的检测方法加深对细胞凋亡现象及本质的理解加深对细胞凋亡现象及本质的理解练习从形态学角度评价细胞凋亡练习从形态学角度评价细胞凋亡掌握荧光显微镜的使用方法掌握荧光显微镜的使用方法第2页，本讲稿共19页细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 实验原理实验原理基本概念：基本概念：细胞凋亡细胞凋亡(ApoptosisApoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条
2、件下，细胞遵循自身的程序，象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于这种死亡方式是由基因调控的自我结束生命的死亡方式。由于这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之为程序性细胞死亡死亡过程，因此又称之为程序性细胞死亡(Programmed Cell Programmed Cell Death)Death)。细胞凋亡有别于细胞坏死。细胞凋亡有别于细胞坏死。第3页，本讲稿共19页似秋叶的凋零，似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；逼细胞步步
3、走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡;第4页，本讲稿共19页n危难中的细胞啊，危难中的细胞啊，n你沉稳不乱，你沉稳不乱，nDNA片片切割，片片切割，n化云梯直通天堂；化云梯直通天堂；n细胞体分团相聚，细胞体分团相聚，n把生命的凝重浓集在小体上；把生命的凝重浓集在小体上；n分别了朝夕相处的伙伴，分别了朝夕相处的伙伴，n再见了快乐美好的时光；再见了快乐美好的时光；n这一切的一切又融入临近的胞体，这一切的一切又融入临近的胞体，n腾出的空间再写生命的篇章。腾出的空间再写生命的篇章。第5页，本讲稿
4、共19页细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别坏死坏死 凋亡凋亡1.性质性质2.诱导因素诱导因素强烈刺激，随机发生强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点生化特点4.形态变化形态变化6.DNA电泳电泳5.炎症反应炎症反应7.凋亡小体凋亡小体8.基因调控基因调控被动过程，无新蛋白合成，不耗能被动过程，无新蛋白合成，不耗能 主动过程，有新蛋白合成，耗能主动过程，有新蛋白合成，耗能细胞结构全面溶解、破坏、细细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀胞肿胀 胞膜及细胞器相对完整细胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩胞皱缩，核固缩弥散性降解，电泳呈均一弥散性降解，电泳呈均一
5、DNA片状片状 DNA片段化（片段化（180-200bp），），电泳呈电泳呈“梯梯”状条带状条带溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎溶酶体相对完整，局部无炎症反应症反应有有病理性，非特异性病理性，非特异性生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性无无有有无无第6页，本讲稿共19页细胞凋亡的形态特征细胞凋亡的形态特征n（1 1）凋凋亡亡的的起起始始；微微绒绒毛毛的的消消失失，细细胞胞间间接接触触的的消消失失，与与周周围围的的细细胞胞脱脱离离，细胞质中，线拉体大体完整，染色质固缩细胞质中，线拉体大体完整，染色质固缩n（2 2）细细胞胞质质密密度度增增加加，线线
6、粒粒体体膜膜电电位位消消失失，通通透透性性改改变变，释释放放细细胞胞色色素素C C到到胞胞浆浆，膜膜内内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面n（3 3）凋凋亡亡小小体体的的形形成成。核核膜膜核核仁仁破破碎碎，核核染染色色质质断断裂裂为为大大小小不不等等的的片片段段，与与某某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围n（4 4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。第7页，本讲稿共19页细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡的形态学特征第8页，本讲稿共19页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病n细
7、胞凋亡不足：细胞凋亡不足：n肿瘤，自身免疫病肿瘤，自身免疫病n细胞凋亡过度：细胞凋亡过度：n心肌缺血，心力衰竭，神经元心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感染退行性疾病，病毒感染第9页，本讲稿共19页细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法基于形态学观察的染色法基于形态学观察的染色法基于基于DNA 片断化的检测法片断化的检测法膜联蛋白检测法膜联蛋白检测法Caspase酶分析法酶分析法流式细胞仪定量分析法流式细胞仪定量分析法细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 实验原理实验原理第10页，本讲稿共19页第11页，本讲稿共19页第12页，本讲稿共19页第13页，本讲稿共19页第1
8、4页，本讲稿共19页细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 实验仪器、材料及试剂实验仪器、材料及试剂1、仪器、用具、仪器、用具：荧光显微镜、显微载玻片、盖玻片、微量荧光显微镜、显微载玻片、盖玻片、微量2、培养的细胞材料：、培养的细胞材料：HeLa细胞细胞3、试剂：、试剂：吖碇橙吖碇橙/溴化乙锭（溴化乙锭（AO/EB)的的PBS溶液：溶液：PBS溶液中分别加入溶液中分别加入100g/mL 的的AO与与100g/mL 的的EB，配成两种溶液，用时再混合。，配成两种溶液，用时再混合。磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS)：800mL蒸馏水中溶解蒸馏水中溶解8g NaCL、0.2g K
9、CL、1.44g Na2HPO4、0.24g kH2PO4，用盐酸调，用盐酸调pH到到7.4，加水定容到，加水定容到1L。高压灭菌保存。高压灭菌保存。移液器、高压灭菌锅、细胞培养用具移液器、高压灭菌锅、细胞培养用具第15页，本讲稿共19页细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 实验步骤实验步骤（1）Hela细胞贴壁生长于DMEM培养液中含10%胎牛血清，置37 5%CO2培养箱中培养23天，待细胞形成单层融合状态。（2）去细胞培养液，加入0.215mol/L双氧水的10%胎牛血清培养液中，继续培养2436小时。（3）收集细胞：用细胞消化液消化细胞使细胞脱壁，制成单细胞悬液。1
10、000X g离心力离心5分钟，弃上清。（4）取25l培养的细胞悬液滴于载玻片上，稍风干后，加入AO/EB 1:1混合液染色，并盖上盖玻片。（5）荧光显微镜下观察。第16页，本讲稿共19页细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 注意事项注意事项1、EB为强诱变剂，使用时要注意防护为强诱变剂，使用时要注意防护2、试剂与细胞孵育完毕后，要立即检测、试剂与细胞孵育完毕后，要立即检测3、正确使用显微镜，保护好镜头和滤光片、正确使用显微镜，保护好镜头和滤光片第17页，本讲稿共19页细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 课后作业及思考课后作业及思考1、练习用、练习用AO
11、/EB法检测凋亡的细胞，掌握荧光显法检测凋亡的细胞，掌握荧光显微镜的使用微镜的使用2、查阅相关文献，理清细胞凋亡与细胞坏死的区别、查阅相关文献，理清细胞凋亡与细胞坏死的区别3、了解其它可用于细胞凋亡检测的方法及其原理、了解其它可用于细胞凋亡检测的方法及其原理第18页，本讲稿共19页1、了解细胞凋亡的最新研究进展，结合自己的、了解细胞凋亡的最新研究进展，结合自己的知识预测未来细胞凋亡的研究方向知识预测未来细胞凋亡的研究方向2、你认为对细胞凋亡机制的深入研究，会对生、你认为对细胞凋亡机制的深入研究，会对生命科学和医学带来何种影响命科学和医学带来何种影响细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 课后作业及思考课后作业及思考?第19页，本讲稿共19页