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1、细胞凋亡及其调控的分子机制细胞凋亡及其调控的分子机制细胞凋亡的基本概念细胞凋亡的基本概念:细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis)(有树叶凋零之意有树叶凋零之意)或或程序化细胞死亡程序化细胞死亡（programmed cell death,PCD)是指多细胞有机体在正常生理或病理情况是指多细胞有机体在正常生理或病理情况下，发生的一种由多基因控制的主动死亡过下，发生的一种由多基因控制的主动死亡过程。程。第一节第一节 凋亡细胞的特征及生物学意义凋亡细胞的特征及生物学意义(一一)细胞凋亡的组织学变化细胞凋亡的组织学变化 n只发生在单个或几个细胞，其紧邻细胞完好；只发生在单个或几个细胞，其紧邻细胞完好；
2、n与紧邻细胞间有空隙，有离群、脱落感；不引起与紧邻细胞间有空隙，有离群、脱落感；不引起炎症反应炎症反应(二二)主要形态学特征主要形态学特征(多阶段多阶段)n凋亡细胞其形态特征表现为细胞皱缩、变小；凋亡细胞其形态特征表现为细胞皱缩、变小；n核固缩，胞质浓缩，细胞急剧变小；核固缩，胞质浓缩，细胞急剧变小；n细胞骨架解体，最后变成若干个凋亡小体。细胞骨架解体，最后变成若干个凋亡小体。注意点：注意点：凋亡全过程，质膜仍保持完整，细胞内容凋亡全过程，质膜仍保持完整，细胞内容物不释放，不引起炎症反应。物不释放，不引起炎症反应。一、细胞凋亡的基本特征一、细胞凋亡的基本特征1.细胞核的变化细胞核的变化 核内染
3、色质凝聚、形成染色质块，并聚集于核的边核内染色质凝聚、形成染色质块，并聚集于核的边缘呈多种形状排列，然后逐步分裂为碎片（核碎片缘呈多种形状排列，然后逐步分裂为碎片（核碎片形成）。形成）。2.细胞质的变化细胞质的变化(1)胞质脱水浓缩，体积减少约胞质脱水浓缩，体积减少约30%(2)细胞器的变化细胞器的变化:A.线粒体早期体积增大，嵴增多线粒体早期体积增大，嵴增多晚期成空泡状晚期成空泡状,B失去微绒毛、细胞突起及细胞表面失去微绒毛、细胞突起及细胞表面皱褶，膜电位下降，膜皱褶，膜电位下降，膜 流动性下降；流动性下降；C.内质网腔内质网腔扩大；扩大；D.细胞骨架变得致密和紊乱。细胞骨架变得致密和紊乱。
4、3.凋亡小体的形成凋亡小体的形成*凋亡小体的概念凋亡小体的概念 指凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等，指凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等，含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体。含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体。*形成机制形成机制（1）细胞表面突起形成）细胞表面突起形成-包裹膜融合、根部缩窄包裹膜融合、根部缩窄脱落脱落（2）胞内自噬体形成）胞内自噬体形成-向胞外释放向胞外释放应指出！有时凋亡细胞膜不分割，仅发生核固缩和应指出！有时凋亡细胞膜不分割，仅发生核固缩和胞质高度浓缩成单个致密结构亦称凋亡小体。胞质高度浓缩成单个致密结构亦称凋亡小体。凋亡时细胞的形态学改变凋亡时细胞的
5、形态学改变空泡化空泡化固缩固缩出芽出芽边集边集凋亡小体凋亡小体 (二二)细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的生化特征1.DNA片段化（主）片段化（主）凋亡细胞凋亡细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳呈特征性经琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯状条带图谱（梯状条带图谱（Ladder）。）。机制：机制：核小体中的组蛋白与核小体中的组蛋白与DNA的连结键断的连结键断裂，内源性核酸内切酶被激活，有控制的特裂，内源性核酸内切酶被激活，有控制的特异地将异地将DNA降解为降解为180200bp整数倍大小整数倍大小的若干条带。的若干条带。DNA FragmentationNucleosomal Banding Pattern3.其它生化
6、改变其它生化改变1)胞浆胞浆Ca2+水平水平 与细胞凋亡的关系密切，实验证明，凋亡的发生伴与细胞凋亡的关系密切，实验证明，凋亡的发生伴随胞浆随胞浆Ca的升高。的升高。2)胞浆胞浆H离子浓度离子浓度 细胞凋亡伴随胞浆细胞凋亡伴随胞浆PH下降。下降。3)线粒体线粒体 凋亡时，呼吸链受损，凋亡时，呼吸链受损，ATP合成下降，膜电位下降合成下降，膜电位下降(m)；膜通透性增加。；膜通透性增加。4)细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻 膜磷脂的不对称性分布改变膜磷脂的不对称性分布改变,凋亡时凋亡时PS由质膜内由质膜内侧翻向外侧侧翻向外侧.（二）细胞凋亡与坏死的区别（二）细胞凋亡与坏死的区别-1细
7、胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死诱导因素诱导因素细胞数量细胞数量膜完整性膜完整性染色质染色质细胞核细胞核细胞器细胞器胞内容物胞内容物生理性、弱刺激性生理性、弱刺激性单个细胞丢失单个细胞丢失保持至晚保持至晚凝聚呈半月状凝聚呈半月状早期固缩、断裂早期固缩、断裂无明显变化无明显变化无释放无释放强烈刺激强烈刺激成群细胞死亡成群细胞死亡早期即丧失早期即丧失稀疏呈网状稀疏呈网状晚期破碎晚期破碎肿胀、破坏肿胀、破坏释放释放细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死细胞形状细胞形状基因组基因组DNA大分子合成大分子合成基因调控基因调控后果后果意义意义形成凋亡小体形成凋亡小体受调控降解受调控降解一般需要一般需要有有不引起炎
8、症反应不引起炎症反应生理性死亡生理性死亡破裂成碎片破裂成碎片随机降解随机降解不需要不需要无无引起炎症反应引起炎症反应病理性死亡病理性死亡 细胞凋亡与坏死的区别细胞凋亡与坏死的区别-2二、细胞凋亡的广泛性及其意义二、细胞凋亡的广泛性及其意义 作为一种生理性细胞消亡方式，普遍存作为一种生理性细胞消亡方式，普遍存在生物界；例如：在生物界；例如：1 高等脊椎动物胚胎发育中某些细胞的丢失高等脊椎动物胚胎发育中某些细胞的丢失;2 两栖类动物变态过程中幼体器官的退化两栖类动物变态过程中幼体器官的退化;3 成熟个体中亦有细胞凋亡发生，如：血细胞、上皮成熟个体中亦有细胞凋亡发生，如：血细胞、上皮细胞、肝细胞等以
9、正常细胞更新衰老细胞过程；细胞、肝细胞等以正常细胞更新衰老细胞过程；4 通过凋亡清除受损伤或癌前病变的细胞通过凋亡清除受损伤或癌前病变的细胞,防止癌变防止癌变;5 病毒、药物、毒物等均能诱发细胞凋亡。病毒、药物、毒物等均能诱发细胞凋亡。细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡的生物学意义其一其一:具有清除个体发育过程及成熟个体中多具有清除个体发育过程及成熟个体中多余细胞及老化细胞的机体调节作用余细胞及老化细胞的机体调节作用其二其二:具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒感染细胞的机体防御作用感染细胞的机体防御作用 因此，因此，细胞凋亡是维持个体生存所必需的细胞凋亡是维持个体生
10、存所必需的一种生物学机制一种生物学机制细胞凋亡的发生机制细胞凋亡的发生机制一、细胞凋亡的酶学基础一、细胞凋亡的酶学基础n细胞内一系列蛋白酶和核酸酶的活化是凋细胞内一系列蛋白酶和核酸酶的活化是凋亡过程的核心事件。亡过程的核心事件。n有人甚至认为细胞凋亡过程就是蛋白酶级有人甚至认为细胞凋亡过程就是蛋白酶级联反应的过程。联反应的过程。（一）（一）caspase家族与细胞凋亡家族与细胞凋亡nCaspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specific protease);n是一类与白介素是一类与白介素-1 转化酶和线虫凋亡基因转化
11、酶和线虫凋亡基因Ced(ICE/Ced)同源的一类半胱氨酸蛋白酶同源的一类半胱氨酸蛋白酶;n活性位点含有保守的活性位点含有保守的aa序列序列(QACXG,X为为R,Q或或G);n以无活性的酶原形式合成并存在于细胞中；以无活性的酶原形式合成并存在于细胞中；n可以被上游可以被上游Caspase或自身切割保守的或自身切割保守的ASP活化；活化；1.Caspase的性质和种类的性质和种类n已在哺乳类中发现已在哺乳类中发现14种，分为种，分为3个亚类：个亚类：nCaspase-1亚家族，亚家族，Caspase-2亚家族，亚家族，Caspase-3亚家族亚家族n亦可根据前体分子亦可根据前体分子(proca
12、spase)N端的原结端的原结构域构域(prodomain)分为分为2类类:n具具”Long-prodomain”的启始分子的启始分子(initiator),如如-8、-9、-10等，为蛋白酶级联反应的启始者，等，为蛋白酶级联反应的启始者，其活化后再切割和活化下游其活化后再切割和活化下游Caspase；n具具”short-prodomain”的效应分子的效应分子(effector),如如-3、-6、-7等，作为上游酶的底物被切割活化，等，作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。2.Caspase的结构特点和活化机制的结构特点和活化
13、机制原结构域原结构域 大亚基大亚基 小亚基小亚基N端端 D28 QACRG D175 IETDCaspase异二聚体化异二聚体化异四聚体化异四聚体化蛋白酶活性蛋白酶活性3.Caspase活化的级联反应过程活化的级联反应过程n多种凋亡因素，通过多种途径活化多种凋亡因素，通过多种途径活化Caspase;Caspase;n凋亡时凋亡时起始起始CaspaseCaspase首先被活化首先被活化,其后又切割其后又切割并活化下游并活化下游Caspase,Caspase,级联放大级联放大,直至直至效应效应CaspaseCaspase被活化；被活化；n细胞中的细胞中的CaspaseCaspase一旦被活化一旦被
14、活化,凋亡即不可避凋亡即不可避免免;4.效应效应caspase引起细胞凋亡的机制引起细胞凋亡的机制 已发现的已发现的caspase底物上百种底物上百种,仅少数底物与凋仅少数底物与凋亡的关系被确认亡的关系被确认;n灭活细胞内凋亡抑制蛋白灭活细胞内凋亡抑制蛋白n非凋亡细胞中非凋亡细胞中,CDA(caspase活化的活化的DNAase)与其抑制与其抑制蛋白蛋白(ICDA)结合结合;n凋亡细胞中凋亡细胞中,caspase剪切剪切ICDA;nCDA游离并进入核内降解游离并进入核内降解DNA,细胞凋亡细胞凋亡.n剪切细胞结构蛋白剪切细胞结构蛋白n如如Caspase对核板的降解作用对核板的降解作用;n 在凋
15、亡过程中在凋亡过程中,caspase在单一位点剪切核纤层蛋白在单一位点剪切核纤层蛋白(lamin),导致核板塌陷导致核板塌陷,染色质浓缩染色质浓缩.n剪切效应蛋白剪切效应蛋白:如参与基因表达蛋白因子如参与基因表达蛋白因子,如如PARPn活化活化caspase抑制剂抑制剂(二二)介导细胞凋亡的其他酶类介导细胞凋亡的其他酶类n核酸内切酶核酸内切酶(endonuclease)n主要是主要是DNase,包括包括DNase、DNase、NUC18等；等；n大多数大多数DNase在细胞凋亡时作为在细胞凋亡时作为caspase的底物被活化的底物被活化并发挥作用，如并发挥作用，如CAD等；等；n其作用点是核小
16、体的连接处切割其作用点是核小体的连接处切割DNA，产生，产生180200bp的的Ladder.n蛋白激酶蛋白激酶(protein kinase，PK)nPKC可通过可通过caspase相互作用影响细胞凋亡；相互作用影响细胞凋亡；nDNA-PK（DNA依赖性蛋白激酶），活化后参与依赖性蛋白激酶），活化后参与DNA损损伤与修复，能抑制凋亡，伤与修复，能抑制凋亡，能被能被caspase-3灭活。灭活。n其他酶类：其他酶类：n丝氨酸蛋白酶（如粒酶丝氨酸蛋白酶（如粒酶B）、）、calpain、NOS等等二、细胞凋亡的信号传递途径二、细胞凋亡的信号传递途径n细胞凋亡的影响信号分为细胞凋亡的影响信号分为2类
17、：类：n一类为凋亡的负调控信号（抑制凋亡）；一类为凋亡的负调控信号（抑制凋亡）；n另类为凋亡的正调控信号（诱导凋亡）另类为凋亡的正调控信号（诱导凋亡）n细胞凋亡信号转导通路的特点：细胞凋亡信号转导通路的特点：n同一性：同一性：各种因素引起的凋亡的形态与生化改变各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。均相同。n 多样性：多样性：环境因素不同，细胞类型不同，或刺环境因素不同，细胞类型不同，或刺激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。信号传递途径是不同的。n 分类：分类：百余种凋亡调控因子，正逐渐被组装成百余种凋亡调控因子，正逐渐被
18、组装成一条条的信息传导通路，可分为一条条的信息传导通路，可分为基本传导通路基本传导通路和和非专一性传导通路二类。非专一性传导通路二类。（一）死亡受体介导的细胞凋亡（一）死亡受体介导的细胞凋亡n死亡受体死亡受体(death receptors,DR)：n指细胞表面存在的一类能结合凋亡剌激分子，并指细胞表面存在的一类能结合凋亡剌激分子，并将信号传递至胞内引起细胞凋亡的受体。将信号传递至胞内引起细胞凋亡的受体。n属肿瘤坏死因子受体（属肿瘤坏死因子受体（TNF）超家族；）超家族；n包括包括16个富个富Cys结构域组成的保守的胞外区，结构域组成的保守的胞外区，和一个由和一个由6080aa组成的组成的“死
19、亡结构域死亡结构域”(death domain,DD)；nDD将受体信号与胞内凋亡机制相偶联；将受体信号与胞内凋亡机制相偶联；n分类：分类：CD95(Fas/Apol),TNFR1,TNFR2,DR3(Apol3/Esl1)等近十种。等近十种。n“死亡结构域死亡结构域”n概念：概念：是凋亡信号受体共有的、存在于胞内的转导是凋亡信号受体共有的、存在于胞内的转导细胞凋亡所必需的一段高度同源的细胞凋亡所必需的一段高度同源的aa序列。序列。n种类：种类：nFADD：fas-associated death domain(Fas相关的相关的死亡结构域死亡结构域)；nTRADD：TNF recptor-a
20、ssociated death domain(TNF1受体相关的死亡结构域受体相关的死亡结构域)；nRIP：receptor interacting protein(受体相互作用受体相互作用蛋白蛋白)（含相似的死亡域）（含相似的死亡域）nDD的活化或过表达都会导致细胞凋亡的活化或过表达都会导致细胞凋亡.TNFTNFTNFDDDDDDTNFR1DDDD死死亡亡诱诱导导信信号号复复合合物物(DISC)形形成成DDRIPDDFADDDED活化活化NF-B，AP-1促进炎症，促进炎症，免疫反应等免疫反应等活化活化Caspase-8Caspase级联放大级联放大细胞凋亡细胞凋亡TRADD（二）线粒体相关
21、蛋白的凋亡诱导途径（二）线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径n线粒体细胞凋亡过程中既是引发器，又是信号放大线粒体细胞凋亡过程中既是引发器，又是信号放大器；器；n几乎所有的诱导剂引起的细胞凋亡都伴随着线粒体几乎所有的诱导剂引起的细胞凋亡都伴随着线粒体跨膜电位跨膜电位(m)的下降的下降;nm的维持，与线粒体膜通透性转运孔（的维持，与线粒体膜通透性转运孔（MPT）部）部分相关；分相关；n几乎所有的凋亡诱导因素导致几乎所有的凋亡诱导因素导致MPT破坏或开放；破坏或开放；n开放的后果是，开放的后果是，m 下降、氧化磷化脱偶联、下降、氧化磷化脱偶联、GSH耗竭、耗竭、ROS产生等，并形成恶习性循环。产生等，并形成
22、恶习性循环。nMPT的这种自我放大效应，很可能是一种细胞死亡的这种自我放大效应，很可能是一种细胞死亡“全或无全或无”的开关。的开关。n线粒体释放的凋亡诱导分子线粒体释放的凋亡诱导分子n在多种诱导因子（如在多种诱导因子（如Bax过表达、过表达、UV照射）作照射）作用下，用下，MPT开放和开放和外膜破坏；外膜破坏；n线粒体粒体释放多种凋亡相关分子，如放多种凋亡相关分子，如CytC、Smac、Endo G等等n细胞色素胞色素C：n释放到胞放到胞质中的中的CytC，可特异性地，可特异性地结合接合接头蛋蛋白白Apaf并使之寡聚化，并使之寡聚化，nApaf借助借助N-端端caspase 相关征相关征蓦结构
23、域构域（CARD）,直接直接蓦集多个集多个caspase-9并使之活并使之活-凋亡。凋亡。（三）细胞核凋亡诱导途径（略）（三）细胞核凋亡诱导途径（略）n细胞毒细胞毒T淋巴细胞杀伤靶细胞的机制之一，淋巴细胞杀伤靶细胞的机制之一，就是通过粒酶就是通过粒酶B来实现的。来实现的。n粒酶粒酶B的特点的特点n粒酶（粒酶（cranzyme,Cr）是）是CTL和和NK细胞杀细胞杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称；伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称；n首先酶原形式合成，受刺激后激活；首先酶原形式合成，受刺激后激活；n已发现已发现5种：种：CrA、B，H、M和类胰蛋白和类胰蛋白酶酶-2;n其中以其中以CrB促凋亡作
24、用最强促凋亡作用最强;（三）粒酶（三）粒酶B介导的细胞凋亡介导的细胞凋亡n粒酶粒酶B诱导细胞凋亡的途径诱导细胞凋亡的途径nCrB由由CTL分泌进入靶细胞胞浆后分泌进入靶细胞胞浆后,其丝氨酸蛋白其丝氨酸蛋白酶在胞浆酶在胞浆pH7.0条件下发挥最佳活性，切割胞浆条件下发挥最佳活性，切割胞浆和核中的多种底物；和核中的多种底物；n以此介导的死亡途径是多层次、多水平的，以便以此介导的死亡途径是多层次、多水平的，以便快速清除异常细胞快速清除异常细胞；nCaspase依赖的死亡通路是依赖的死亡通路是CrB介导细胞死亡的介导细胞死亡的重要途径之一：重要途径之一：在体外，在体外，pro-Caspase家族中，除
25、家族中，除-1外其余的都外其余的都可被可被CrB切割活化，切割活化，-10和和-7是是CrB的最适底物；的最适底物；n线粒体介导的死亡途径是另一个重要的途径：线粒体介导的死亡途径是另一个重要的途径：需要多种蛋白质（如需要多种蛋白质（如Bax、Bid、Bak）参与，与）参与，与线粒体膜通透性及线粒体膜通透性及m 有关。有关。死亡受体死亡受体(Fas/CD95,TNFR1)CD95配体配体,TNF-FADDCaspase-8,10Caspase-3,6,7PARP,Lamin,PK,DNA-PKDNA断裂断裂,细胞固缩等细胞固缩等细胞凋亡细胞凋亡Caspase激活物激活物起始起始Caspase效应
26、效应CaspaseCaspase底物底物CTL粒酶粒酶B,穿孔素穿孔素胞外胞外CrB生长因子撤除生长因子撤除,化学药物等化学药物等Cyt CApaf-1Caspase-9AIF,endo G凋亡主要途径小结凋亡主要途径小结第三节第三节 细胞凋亡的调控细胞凋亡的调控 目前普遍认为，细胞凋亡与细胞分裂、分目前普遍认为，细胞凋亡与细胞分裂、分化类似，受细胞内多种基因的调控，是一化类似，受细胞内多种基因的调控，是一个级联式基因表达的结果。个级联式基因表达的结果。已发现许多基因参与细胞凋亡的基因调控，已发现许多基因参与细胞凋亡的基因调控，包括：包括：ced、bcl-2、ICE、p53、IAP家族、家族、
27、Fas/Apo、c-myc等。等。至今调控机理尚未十分明了。至今调控机理尚未十分明了。nP53的结构：的结构：np53基因位于人染色体的基因位于人染色体的17 p13.17，编码，编码53kDa的的P53蛋白转录因子；蛋白转录因子；n野生型野生型P53蛋白由蛋白由393aa组成，活性形式为四组成，活性形式为四聚体；聚体；n自自N端起包括：转录活化区、端起包括：转录活化区、DNA结合区、结合区、四聚体化区和四聚体化区和C-调节区；调节区；nC-端的端的26aa构成一个开放的结构域，易被降构成一个开放的结构域，易被降解或磷酸化修饰，受其他蛋白调节。解或磷酸化修饰，受其他蛋白调节。一、细胞自身蛋白的
28、调控作用一、细胞自身蛋白的调控作用（一）（一）P53蛋白的调控作用蛋白的调控作用nP53的表达与活性调节的表达与活性调节n正常状态下：正常状态下：n胞浆胞浆P53水平很低，半衰期很短，水平很低，半衰期很短，n胞内胞内P53被严格监控，受被严格监控，受HDM2的负反馈调节，的负反馈调节，并通过泛素降解途径调节并通过泛素降解途径调节P53水平。水平。n异常情况下：异常情况下：n当细胞当细胞DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时；表达等细胞生存面临威胁时；nP53水平迅速升高和活化；水平迅速升高和活化；nP53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用对细胞凋
29、亡和细胞周期的调节作用n野生型野生型P53蛋白：蛋白：n具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用；具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用；nP53蛋白作为蛋白作为“基因警卫基因警卫”负责维持基因组的完负责维持基因组的完整性、整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转；损伤修复和细胞周期的正常运转；n如果损伤不能修复，如果损伤不能修复，P53就激活那些诱导凋亡的就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。基因表达，使细胞进入凋亡状态。n突变型突变型P53蛋白：蛋白：n丧失抑制细胞恶性增殖功能，丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53基因突变是基因突变是50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因
30、;n并且本身具有癌基因功能。并且本身具有癌基因功能。P53蛋白蛋白基因卫士基因卫士P53蛋白蛋白解链酶解链酶复制因子复制因子A AP21蛋白蛋白细胞停滞于细胞停滞于G G1 1期期细胞凋亡细胞凋亡酸性区酸性区核心区核心区碱性区碱性区P53蛋白蛋白 DNA损伤损伤P21基因基因P53蛋白蛋白抑抑 制制P53蛋白蛋白成功修复成功修复修复失败修复失败细细胞胞周周期期(二二)Bcl-2基因家族基因家族bcl-2基因基因nbcl-2基因发现于基因发现于1985年。定位于年。定位于18q21 基因长约基因长约230kb（2个内含子各个内含子各3 个外显子），编码个外显子），编码23kd膜镶嵌蛋膜镶嵌蛋白质
31、，与白质，与Ced-9有有23%的同源性。的同源性。n Bcl-2对需要长期生存的细胞对需要长期生存的细胞,如神经细胞、免疫记如神经细胞、免疫记忆细胞和造血祖细胞等的寿命有重要意义。忆细胞和造血祖细胞等的寿命有重要意义。n急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，慢性粒急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，慢性粒细胞白血病，细胞膜内细胞白血病，细胞膜内Bcl-2蛋白质增加显著。蛋白质增加显著。Bcl-2的功能的功能n属属凋亡抑制基因凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响胞寿命，但对细胞周期和分化无影响n阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。如阻止或减少
32、各种刺激引起的细胞损伤。如Bcl-2能阻止由能阻止由r射线和多种化疗药导致的细射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。胞凋亡。nBcl-2蛋白具抗氧化作用蛋白具抗氧化作用nBcl-2蛋白抑制细胞器内蛋白抑制细胞器内Ca2+离子向胞质释离子向胞质释放，而凋亡必须有放，而凋亡必须有Ca2+离子参与离子参与。bcl-2家族家族 家族成员家族成员 可能存在的聚合体形式可能存在的聚合体形式抑抑制制凋凋亡亡促促进进凋凋亡亡bcl-2 Bcl-2/Bcl-2 Bax/Bcl-2bcl-xL Bcl-xL/bcl-xL Bcl-2/Bcl-xL bax Bax/Bax Bax/Bcl-2bad Bad/Bcl-2 B
33、ad/Bcl-xL bcl-xs Bcl-xs/Bcl-2 Bcl-xs/Bcl-xL Mcl-1 Mcl-1/bcl-xL Mcl-1/Bcl-2Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制家族对细胞凋亡的调节机制Bcl-2、Bax和和Bcl-x组成一个凋亡调控系统组成一个凋亡调控系统n当当Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡；凋亡；n随随bcl-2表达量增加，渐多的表达量增加，渐多的Bax/Bax解聚，解聚，形成更稳定的形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中异源二聚体，从而中和了和了Bax/Bax诱导凋亡的作用。即诱导凋亡的作用。即Bax和和Bcl-2
34、 比值调节凋亡比值调节凋亡；n当当Bcl-xs存在时，优先形成存在时，优先形成Bcl-xs/Bcl-2，使使Bax/Bax形式保留，诱导细胞凋亡。形式保留，诱导细胞凋亡。第四节第四节 检测细胞凋亡的常用技术检测细胞凋亡的常用技术 一、凋亡的形态学检查（光镜、电镜）一、凋亡的形态学检查（光镜、电镜）1 苏木素苏木素伊红（伊红（HE）染色法）染色法:应用范围：应用范围：石蜡组织切片、细胞涂片石蜡组织切片、细胞涂片结果判断：结果判断：n正常细胞保持原生长形状，梭形或多角形；细胞核正常细胞保持原生长形状，梭形或多角形；细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡黄色。呈蓝黑色，胞浆呈淡黄色。n凋亡细胞表现为核染色致密浓缩
35、、核碎裂；凋亡细凋亡细胞表现为核染色致密浓缩、核碎裂；凋亡细胞涂片可见凋亡小体。胞涂片可见凋亡小体。n坏死细胞呈均质红染，无结构、核染色消失。坏死细胞呈均质红染，无结构、核染色消失。2.甲基绿甲基绿派诺宁染色法派诺宁染色法:3.Giemsa 染色法染色法:4.瑞氏瑞氏(Wright)染色法染色法5.透射电子显微镜观察法透射电子显微镜观察法二、荧光显微镜观察法二、荧光显微镜观察法吖啶橙染色法、吖啶橙染色法、Hoechst染色法染色法Hoechst染色法染色法（一）琼脂糖凝胶电泳法（一）琼脂糖凝胶电泳法 基本操作步骤：基本操作步骤：n染色体组染色体组DNA提取提取n11.5%琼脂糖电泳琼脂糖电泳(
36、含含EB)n电泳后于紫外灯下观察并照相留底电泳后于紫外灯下观察并照相留底n有无有无200bp左右的左右的ladder出现作为判断细胞出现作为判断细胞凋亡凋亡n 亦可进行聚丙烯酰胺凝胶电泳亦可进行聚丙烯酰胺凝胶电泳.三、凋亡细胞的生化特征的检测三、凋亡细胞的生化特征的检测(二二)原位末端标记技术原位末端标记技术 (in situ end lableing,ISEL)原理原理:ISEL的原理是基于细胞凋亡时，的原理是基于细胞凋亡时，DNA断裂，利断裂，利用末端脱氧核苷酸转移酶（用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）或）或DNA聚合酶将聚合酶将带有生物素标记的核苷酸（带有生物素标记的核苷酸（biotin-
37、16-dUTP）掺入）掺入到断裂的到断裂的DNA的的3端，再使其与带有辣根过氧化物端，再使其与带有辣根过氧化物酶的抗生物蛋白结合，经酶的抗生物蛋白结合，经DAB显色后，便可观察到显色后，便可观察到细胞内是否存在细胞内是否存在DNA片段端存在。片段端存在。主要方法有主要方法有2种种:1.TdT介导的介导的dUTP缺口末端标记缺口末端标记(TUNEL)2.DNA聚合酶聚合酶I 或或klenow大片段介导的原位的缺口平大片段介导的原位的缺口平移移(ISNT)n该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞.四、凋亡细胞的流式细胞术检测四、凋亡细胞的流式细胞术
38、检测基本操作步骤基本操作步骤:离心收集细胞离心收集细胞-重悬于重悬于70%乙醇乙醇,-20固定固定24小时小时-离心后重悬细胞离心后重悬细胞PBS缓冲液缓冲液-加加PI（碘化丙啶）染色（碘化丙啶）染色(含含RNaseA),37保温保温30min-流式细胞术分析流式细胞术分析 亦可用亦可用PI/Hoechst双染双染.通过亚二倍体峰的的有无及面积积分来评断通过亚二倍体峰的的有无及面积积分来评断细胞凋亡细胞凋亡.第六节第六节 细胞凋亡与临床疾病细胞凋亡与临床疾病 机体的生存取决于机体是否于平衡状态，机体的生存取决于机体是否于平衡状态，而最重要的平衡是细胞数量的平衡，这种平衡而最重要的平衡是细胞数量
39、的平衡，这种平衡又取决于细胞增殖与细胞凋亡（及坏死）。又取决于细胞增殖与细胞凋亡（及坏死）。细胞凋亡是多细胞生物体内一个重要的生细胞凋亡是多细胞生物体内一个重要的生命现象，既可发生在个体发育过程和成体正常命现象，既可发生在个体发育过程和成体正常生理过程；亦可发生疾病发生发展过程。生理过程；亦可发生疾病发生发展过程。细胞凋亡的失调与许多疾病密切相关，包细胞凋亡的失调与许多疾病密切相关，包括肿瘤、神经变性、自身免疫、心脏疾病等。括肿瘤、神经变性、自身免疫、心脏疾病等。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病 细胞凋亡减少有关细胞凋亡减少有关细胞凋亡增加有关细胞凋亡增加有关1.癌症癌症:淋巴癌淋巴癌 P53突变
40、所致癌突变所致癌 依赖于激素引起的癌依赖于激素引起的癌2.自身免疫性疾病自身免疫性疾病 红斑浓疮红斑浓疮 免疫介导的肾小管肾炎免疫介导的肾小管肾炎3.病毒感染病毒感染 疱疹病毒疱疹病毒 腺病毒腺病毒 痘病毒痘病毒1.AIDS2.神经退行性病变神经退行性病变 帕金森病帕金森病 老年痴呆老年痴呆3.再生性障碍贫血再生性障碍贫血4.缺血性损伤缺血性损伤 心肌梗塞心肌梗塞 脑卒中脑卒中 再灌注损伤再灌注损伤5.酒精肝酒精肝一、细胞凋亡自身免疫性疾病一、细胞凋亡自身免疫性疾病正常情况下：正常情况下：n90%以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会发生凋亡，以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会发生凋亡，那些能识别自身抗原
41、的细胞都应被清除，确保被那些能识别自身抗原的细胞都应被清除，确保被选择生存下来的淋巴细胞不至于对自身抗原产生选择生存下来的淋巴细胞不至于对自身抗原产生免疫应答；免疫应答；n如果这种选择性清除失败，在靶细胞存在下，淋如果这种选择性清除失败，在靶细胞存在下，淋巴细胞被激活，产生大量的效应细胞攻击靶细胞，巴细胞被激活，产生大量的效应细胞攻击靶细胞，导致发生自身免疫性疾病。导致发生自身免疫性疾病。发病的分子机制：发病的分子机制：n淋巴细胞中调节细胞凋亡的一个关键分子是细胞淋巴细胞中调节细胞凋亡的一个关键分子是细胞表面受体表面受体Fas（又称（又称APO或或CD95），），Fas受体与受体与FasL（配
42、体）结合即可激活凋亡信号传导途径，细（配体）结合即可激活凋亡信号传导途径，细胞凋亡；胞凋亡；nT细胞表面受体细胞表面受体Fas和和FasL发生突变时，发生突变时，T细胞不细胞不能发生正常凋亡，导致自身免疫性疾病。能发生正常凋亡，导致自身免疫性疾病。n除系统性红斑狼疮外，还证实类风湿性关节炎、除系统性红斑狼疮外，还证实类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癣均与淋巴细胞凋亡敏感自身免疫性糖尿病、牛皮癣均与淋巴细胞凋亡敏感性改变（性改变（Fas和和FasL突变）有关。突变）有关。二、细胞凋亡病毒性疾病二、细胞凋亡病毒性疾病 现已证明，病毒的溶解性感染所产生的细胞病现已证明，病毒的溶解性感染所产生的
43、细胞病变变作用与引发细胞凋亡有关；而病毒的持续性感变变作用与引发细胞凋亡有关；而病毒的持续性感染与病毒抑制细胞凋亡有关。染与病毒抑制细胞凋亡有关。n病毒感染引发细胞凋亡：病毒感染引发细胞凋亡：牛疱疹病毒、鸡白血病毒牛疱疹病毒、鸡白血病毒和和HIV等，均能通过诱导细胞凋亡而引起宿主细胞等，均能通过诱导细胞凋亡而引起宿主细胞缺失。如缺失。如HIV感染后引起感染后引起CD4+T细胞凋亡而缺失。细胞凋亡而缺失。n病毒感染抑制细胞凋亡：病毒感染抑制细胞凋亡：许多病毒具有抑制细胞凋许多病毒具有抑制细胞凋亡的机制，有利于建立持续感染、延长病毒复制时亡的机制，有利于建立持续感染、延长病毒复制时间、以最大限度产
44、生子代病毒。如间、以最大限度产生子代病毒。如EB病毒产生病毒产生LMP-1，使，使Bcl-2基因上调；牛痘病毒产生基因上调；牛痘病毒产生crmA,可可抑制由抑制由caspase所介导的细胞凋亡。所介导的细胞凋亡。三、细胞凋亡与肿瘤三、细胞凋亡与肿瘤 现已证明，肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常疾现已证明，肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常疾病，同时也是细胞凋亡异常疾病。病，同时也是细胞凋亡异常疾病。n大多数肿瘤大多数肿瘤P53突变、而有些肿瘤过度表达突变、而有些肿瘤过度表达Bcl-2蛋蛋白，这些可有效地以避免细胞凋亡发生。白，这些可有效地以避免细胞凋亡发生。nP53蛋白作为蛋白作为“基因警卫基因警卫”负责维持基因组的完整负责维持基因组的完整性、性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转。如果损损伤修复和细胞周期的正常运转。如果损伤不能修复，伤不能修复，P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。使细胞进入凋亡状态。nBcl-2属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命。寿命。