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1、动 物 学 研 究20082008，Aug.29(4)Aug.29(4)：399-404 CN399-404 CN53-1040/Q ISSN53-1040/Q ISSN 0254-58530254-5853ZoologicalZoological Research doi:10.3724/SP.J.1141.2008.04399Research doi:10.3724/SP.J.1141.2008.04399白唇竹叶青蛇毒 5 5-核苷酸酶的分离纯化及性质陈 夏，余晓东*，邓 敏，李 卉，林亦心，和七一，柳建平（重庆师范大学 生命科学学院，重庆市生物活性物质工程研究中心，重庆市动物生物学重点
2、实验室，重庆 400047）摘要：用 DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100 和 CM-SephadexC-50 三步柱层析分离法，从白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒中分离纯化出具有 5-核苷酸酶活性的组分。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为 48.03kDa，HPLC 柱层析图谱为单一峰。该组分是一个糖蛋白，以一磷酸腺苷（AMP）为底物时，其酶活力为 330.33g Pi/（minmg）；而以二磷酸腺苷（ADP）为底物时，其酶活力为 123.56g Pi/（minmg）。金属2+3+2+离子 Zn、Fe 和 Cu 对 5-核苷酸
3、酶活性有显著的抑制作用，EDTA可完全抑制其酶活性。该酶的最适 pH 为 9，最适温度为 50。该组分还具有抑制由 ADP 诱导的血小板聚集的生物功能。关键词：白唇竹叶青蛇毒；5-核苷酸酶;分离纯化中图分类号：Q502；Q959.6文献标识码：A文章编号：0254-5853-(2008)04-0399-06Purification and Characterization of 5Purification and Characterization of 5-nucleotidase from-nucleotidase fromTrimeresurus albolabrisTrimeresuru
4、s albolabrisVenomVenomCHEN Xia,YU Xiao-dong*,DENG Min,LI Hui,LIN Yi-xin,HE Qi-yi,LIU Jian-ping(College of Life Science,Chongqing Normal University;Chongqing Engineering Research Center of Bioactive Substance;Chongqing Key Laboratory of Animal Biology,Chongqing 400047)Abstract:Abstract:A 5-nucleotida
5、se was isolated and purified from the snake venom ofT.albolabris using three steps ofchromatography including DEAE-SephadexA-25,Sephadex-G-100 and CM-Sephadex C-50.Using SDS-PAGE andHPLC column chromatography the purified 5-nucleotidase proved to be homogenous.It was a glycoprotein with amolecular w
6、eight of 48.03 kDa.The enzymatic activities of the purified 5-nucleotidase were 330.33 g Pi/min mg and123.56g Pi/min mg when using AMP（adenosine monophosphate）and ADP（adenosine diphosphate）as substrates,2+3+2+respectively.Metal ions,including Zn,Feand Cu,could inhibit 5-nucleotidase activity,as did
7、EDTA.Its optimumpH was nine and its optimum temperature was 50C.It has a potent inhibitory effect on rabbit platelet aggregationinduced by ADP.Key words:Key words:Trimeresurus albolabris；Snake venom;5-nucleotidase;Isolation and purification5-核苷酸酶是一种磷酸酯酶，主要分布于动植物细胞、细菌及动物毒液中（Li，2004）。它能水解5-单核苷酸，产生核苷。为
8、此，作为一种工具酶，已被广泛用于基因工程和核酸研究。同时，该酶也具有重要的生物功能，如在细胞生长发育、运动、纤维蛋白合成、神经传递、提高表皮或内皮屏障功能及淋巴细胞的黏附、再循环、免疫应答等方面均发挥重要的作用（Colgan et al，2006）。不同生物来源和同种生物不同组织细胞来源的 5-核苷酸酶的理化、酶学性质和生物功能存在一定的差异（Strter，2006）。尤其是从不同种蛇毒来源的 5-收稿日期：2008-01-30；接受日期：2008-05-27核苷酸酶在生物功能上显示出差异，如从棕点竹叶青（Trimeresurus.gramineus）蛇毒中分离出的5-核苷酸酶，具有抑制由AD
9、P、花生四烯酸（AA）、胶原蛋白、低浓度凝血酶和Ionophor（A-23187）诱导的血小板聚集的活性（Ouyang&Huang，1983）；从竹叶青(T.Stejnegeri)蛇毒分离出的5-核苷酸酶能抑制ADP、AA、TMVA、凝血酶诱导的血小板聚集，而且对ADP诱导的血小板聚集还有明显的解聚作用（Yu et al，1997）；眼镜蛇（Naja naja）毒的5-核苷酸酶具有抗凝血作用（Dhananiaya et al，2006）。我们曾对我 国重庆金佛山产的白唇竹叶青（T.基金项目：重庆市自然科学基金重点项目（CSTC2006BA5032）；重庆市教委基金项目(KJ080824)*通讯
10、作者（Corresponding author），E-mail:400动物学研究 29卷albolabris）蛇毒粗毒进行检测，发现具有 5-核苷酸酶活性，但目前对该蛇毒5-核苷酸酶的研究还未曾见报道。为此，本文从白唇竹叶青（T.albolabris）蛇毒粗毒中分离纯化该酶，并对其理化和酶学性质及对家兔血小板聚集的作用进行研究，现将我们的研究结果报道如下。1 1材料与方法1.11.1材 料白唇竹叶青毒蛇采自重庆金佛山；健康家兔，体重 5kg20g，购于重庆腾鑫生物技术有限公司；DEAE-SephadexA-25、CM-SephadexC-50和Sephadex G-100(superfine)
11、购自 Amresham 公司；AMP 和 ADP 购自 Amresco 公司；蛋白质 Markers购自 Takara公司；EDTA和 PMSF 为 Sigma 公司产品；其他所用试剂均为国产分析纯。1.21.2仪 器Himac CR 22E 高速冷冻离心机(日本，Hitachi)，Modul YOD-230真空冷冻干燥机(美国，Thermosavant)，PB-10 酸度计(德国，赛多利斯)，BiologicDuoflow 层析系统和UNIVERSAL HOOD S.N凝胶成相系统(美国，Bio-rad)，高效液相色谱仪(HPLC)Waters600(美国，Waters)，8500 型紫外分
12、光光度计（上海天美），LBY-NJ4 血小板聚集仪（北京普利生）。1.31.3白唇竹叶青蛇毒 5 5-核苷酸酶的分离纯化白唇竹叶青蛇毒0.5 g溶于0.05mol/L Tris-HCl缓冲液3mL(pH8.3)中，4孵育过夜，完全溶解后离心10min(4，5000r/min)，取上清，上样于用同样缓冲液平衡好的 DEAE-SephadexA-25柱，用 01mol/L NaCl 溶液线性梯度洗脱；将具有5-核苷酸酶活性强的分离峰收集浓缩后，上样于SephadexG-100柱，用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.6）洗脱；再将得到的具有5-核苷酸酶活性强的分离峰收集浓缩后，上
13、样于 CM-SephadexC-50柱，用 0.01mol/L醋酸钠缓冲液（pH5.8）洗脱，并用01mol/LNaCl溶液线性梯度洗脱。每次收集的活性组分进行Sephadex G-25除盐、浓缩，然后上下一步色谱柱。1.41.4纯度鉴定和分子量的测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量：分离胶浓度15%，浓缩胶浓度5%，电泳完后用考马斯亮蓝R250染色，用含25%乙醇和10%冰醋酸的混合液脱色。HPLC柱层析：取最后得到的样品20mg，溶于750L0.1%TFA溶液，4500r/min离心5min，取上清液，上样于用0.1%TFA溶液平衡过的C18柱，用066.5%乙腈(溶于0.1%TFA
14、溶液)梯度洗脱，最后用66.5%乙腈0.1%TFA溶液洗脱。1.51.5糖蛋白测定参照 Guang&Qi（1982）方法进行。1.6 51.6 5-核苷酸酶、ADPADP 酶活力测定参照 The Fourth Section of Yunnan Institute ofZooloogy(1976)方法进行，按 Jesudium et al（1976）方法测定无机磷的生成。1.71.7金属离子对酶活力的影响各种金属离子盐（Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+）配成 5mmol/L，与等体积酶溶液（300g/mL）混合，37保温 1h 后稀释成 50g/mL，然后测定其 5-核苷酸酶活
15、性(以 AMP 为底物)。EDTA 作用于酶后，再加入过量金属离子，37保温 1h，检测5-核苷酸酶活性。以不加任何离子的一组作为对照组，酶活力设为 100%。1.81.8抑制剂对酶活性的影响4 种化学抑制剂（苯甲脒、-巯基乙醇、PMSF和 EDTA）分别配成5mmol/L 溶液，分别与等体积酶溶液（300g/mL）混合，37保温 1h 后稀释成50g/mL，然后测定5-核苷酸酶活性(底物为AMP)。以不加任何试剂的一组作为对照组，酶活力设为100%。1.9 pH1.9 pH 对酶活性的影响不同 pH 缓冲液体系组成如下：20mmol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.05.0)；20mmol/
16、L 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH6.07.0)；50mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH8.09.0)；50mmol/L 碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH10.011.0)，所有缓 冲液均含有0.5mmol/L CaCl2和 10mmol/L NaCl 以维持相同盐浓度。样品分别与上述缓冲液混合，室温作用 1h，再测定其 5-核苷酸酶活力(AMP 为底物)。以最高酶活力定义为 100%，计算其他不同 pH 条件下的相对酶活力，以 pH 与酶的相对活力作图。1.101.10温度对酶活性的影响样品置不同温度(10、20、30、40、50、60、70和 80)下保温 1h，然后在同样温度下测定
17、其 5-核苷酸酶活性(AMP 为底物)。以最高酶活力定义为100%，计算其他不同温度条件下的相对酶活力，以温度与酶的相对活力作图。4 期陈夏等：白唇竹叶青蛇毒 5-核苷酸酶的分离纯化及性质 4011.111.11血小板聚集实验富血小板血浆的制备：新鲜的兔血收集于硅烷化的塑料管内，并以3.8%柠檬酸钠 91（V/V）抗凝，室温离心 10min（1000r/min），取上层液即为富血小板血浆（PRP）。剩余血液继续离心 15min（3000r/min），分离出贫血小板血浆（PPP），作为测定时的对照或调节 PRP 中的血小板数。血小板聚集性测定：按 Born 氏比浊法原理，采用 LBY-NJ4血小
18、板聚集仪进行测定。测定结果按下式计算：（对照最大聚集百分率抑制率（）加抑制剂最大聚集抑制百分率）对照最大聚集百分率1002 2结 果2.1 DEAE-SephadexA-252.1 DEAE-SephadexA-25 柱色谱结果分离图谱如图1所示，共分离出13个峰，其中峰的5-核苷酸酶活性最强，将峰收集并在Sephadex G-25上脱盐浓缩后做进一步纯化。2.2 Sephadex2.2 Sephadex G-100G-100柱色谱结果分离图谱如图2所示，共得3个峰，其中峰具有5-核苷酸酶活性。将峰合并收集，浓缩后做进一步纯化。2.3 CM-SephadexC-502.3 CM-Sephade
19、xC-50 柱色谱结果分离图谱如图3所示，共得3个峰，其中峰具5-图 1 DEAE-SephadexA-25柱色谱图Fig.1 DEAE-SephadexA-25 ion exchange chromatograms层析柱:2.0cm60cm；流速:24mL/h；每管收集体积：4mL。Column volume：2.0cm60cm；flow rate：24mLh；liquid volume of eachtube：4mL.图 2 SephadexG-100 柱色谱图Fig.2 Sephadex-G-100 gel filtration chromatograms层析柱：1.0cm100cm；流
20、速：6mL/min；每管收集体积：3mL。Column volume：1.0cm100cm；flow rate：6mLmin；liquid volume ofeach tube：3mL.核苷酸酶活性。将峰合并收集后，在SephadexG-25上脱盐后进行检测。2.4 52.4 5-核苷酸酶的纯度纯化后的5-核苷酸酶组分作SDS-PAGE，其结果如图4所示，呈现为单一条带。测得相对分子量约为48.03kDa。将 CM-SephadexC-50 层析后的第 III 蜂所得样品上 HPLC 层析后，其色谱结果如图 5 所示，在 1012min 时洗脱下一个单一的蛋白峰。2.52.5糖蛋白测定结果聚丙
21、烯酰胺凝胶电泳后的条带切成两份，分别用考马斯亮兰和过碘酸-Schiffs 试剂染色，条带呈粉红色，且位置与考马斯亮兰染色位置一致，表明它是糖蛋白。2.6 52.6 5-核苷酸酶、ADPADP 酶活力测定结果以 AMP 为底物时 5-核苷酸酶活力为 330.33gPi/（minmg），以ADP 为底物时 5-核苷酸酶活力为 123.56g Pi/（minmg）。2.72.7金属离子和抑制剂对酶活力的影响金属离子及抑制剂对5-核苷酸酶活力的影响（AMP 为底物）结果如表 1 所示，Zn2+、Fe3+和 Cu2+对 5-核苷酸酶活性有显著的抑制作用，EDTA 完全抑制了该酶的活力。2.8 pH2.8
22、 pH 对酶活性的影响pH 对白唇竹叶青蛇毒 5-核苷酸酶活性的影响（AMP 为底物）结果见图 6，显示其该酶的最适 pH为 9。2.92.9温度对酶活性的影响温度对白唇竹叶青蛇毒5-核苷酸酶活性的影响（AMP 为底物）结果见图7，显示该酶的最适温度为 50。2.102.10血小板聚集测定结果402动物学研究 29卷图 3 CM-SephadexC-50柱色谱图Fig.3 CM-SephadexC-50 ion exchange chromatograms图 4白唇竹叶青蛇毒 5-核苷酸酶的 SDS-PAGE 图谱Fig.4SDS-PAGE pattern of the 5-nucleotid
23、ase of snakevenom(Trimeresurus albolabris)泳道 M:蛋白质 marker；1:粗毒样品；2:DEAE-SephadexA-25 第 1 峰样品；3:Sephadex G-100 第 2 峰样品；4:CM-SephadexC-50 第 3 峰样品。样品上样量分别为 40、40、40 和 6g。Lane M:protein marker;1:crude venom;2:the first peak afterDEAE-SephadexA-25;3:the second peak after Sephadex G-100;4:thethird peak af
24、ter CM-SephadexC-50.Each sample is 40,40,40,6g.层析柱:2.0cm30cm；流速:20mL/h；每管收集体积：3mL。Column volume：2.0cm30cm;flow rate：20mLh;liquid volume of eachtube：3mL.表 1 1金属离子及抑制剂对白唇竹叶青蛇毒 5 5-核苷酸酶活力(g Pi/min mg)(g Pi/min mg)的影响(n n=3,meanSD)=3,meanSD)Tab.1Tab.1Effect of metal ions and inhibitors on the activity o
25、f 5Effect of metal ions and inhibitors on the activity of 5-nucleotidase-nucleotidase(g Pi/min mg)from snake venom(g Pi/min mg)from snake venom(Trimeresurus albolabrisTrimeresurus albolabris)金属离子（5mmol/L）对照抑制剂(5mmol/L)苯甲脒Mg2+Ca2+Zn2+Fe3+Cu2+EDTAPMSF巯基乙醇0*100 98.40.7 106.82.33.21.0*37.61.0*The values
26、 represent the meanSD,n=3,*P0.01.Student-t analysis.0*91.83.11132.8970.6图 5 HPLC柱层析色谱图Fig.5HPLC chromatograms of 5-nucleotidase层析柱:分析型 C18 柱;流速:2mL/min。Column:C18 analysis;flow rate:2mL/min.白唇竹叶青蛇毒 5-核苷酸酶对 ADP（20mol/L）诱导的家兔血小板聚集具有明显的抑制作用。抑制率与所用 5-核苷酸酶剂量相关(图 8)。3 3讨 论通过 DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-1
27、00 和CM-SephadexC-50 三步柱层析法，我们从我国产的白唇竹叶青蛇毒中首次分离纯化出了5-核苷酸酶组分（图1，2，3），SDS-PAGE和 HPLC 层析结果皆提示该组分为单一组分(图 4，5)，其表观分子量为 48.03kDa，属糖蛋白。其理化和酶学性质实验表明，该 5-核苷酸酶组分与竹叶青属的其他蛇毒来源的 5-核苷酸酶有较多相似点，如它们皆为糖蛋白，其酶活性能皆被 EDTA抑制，Zn2+对其酶活性皆有明显抑制作用；也有不同处，如 Fe3+离子不能完全抑制白唇竹叶青蛇毒 5-核苷酸酶的活性，而能完全抑制竹叶青蛇毒 5-核苷酸酶活性。在最适 pH 方面，白唇竹叶青蛇毒的 5-核
28、苷酸酶为 9，与竹叶青蛇毒中分离出的 5-核苷酸酶相似（Yu et al，1996），但与从眼镜蛇(Najn naja atra)蛇毒中分离的 5-核苷酸酶（最适 pH 为 6.57.0）和从蝮蛇(Agkistrodonblomhoffii)蛇毒中分离的 5-核苷酸酶（最适 pH 为6.86.9）不同。不同种属的蛇毒 5-核苷酸酶的这些异同点可能与它们所处的分类种属亲缘关系有4 期陈夏等：白唇竹叶青蛇毒 5-核苷酸酶的分离纯化及性质 403图 6 pH对白唇竹叶青蛇毒5-核苷酸酶活力的影响（meanSD,n=3）Fig.6 Effect of pH on the activity of 5-n
29、ucleotidase fromsnake venom(Trimeresurus albolabris)（meanSD,n=3）图 8白唇竹叶青蛇毒 5-核苷酸酶对 ADP（20mol/L）诱导的家兔血小板聚集的影响(meanSD,n=3)Fig.8 The effect of T.albolabris 5-nucleotidase onrabbit platelet aggregation induced by ADP(20 mol/L)(meanSD,n=3)A：对照，未加 5-核苷酸酶；B、C、D：加 5-核苷酸酶（分别为 25，50 和 100g/mL）。A:control,absen
30、ce of 5-nucleotidase;B,C and D:5-nucleotidase withrespectively 25，50 and 100g/mL.参考文献：Chandrarajan J,Klein L.1976.Determination of inorganic phosphorus inthe presence of organic phosphorus and high concentrations of proteinsJ.Analytical Biochemistry,7272(1-2):407-412.Colgan SP,Eltzschig HK,Eckle T,T
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33、anSD,n=3）Fig.7Effect of temperature on the activity of 5-nucleotidasefrom snake venom(T.albolabris)（meanSD,n=3）关，值得进一步探讨。温度对白唇竹叶青蛇毒5-核苷酸酶的影响实验表明，最适温度在50左右（图 7），并且在 50作用 30min 活性不变，提示它是一个热稳定性蛋白。蛇毒中的抗凝血因子很多，直接作用于血小板从而发挥促凝和抗凝血作用的组分也不少（White，2005；Oyama Takahashi，2007）。蛇毒5-核苷酸酶通过作用于血小板发挥抗凝血功能。Ouyang&Huan
34、g（1983）对棕点竹叶青蛇毒5-核苷酸酶的研究以及Yu et al（1997）对竹叶青蛇毒5-核苷酸酶的研究结果表明，蛇毒5-核苷酸酶通过作用于血小板发挥抗凝血功能。血小板聚集实验表明从白唇竹叶青蛇毒得到的 5-核苷酸酶组分也能抑制由 ADP诱导的家兔血小板血浆的聚集，且抑制率与5-核苷酸酶的量呈正相关（图8），但其抗血小板聚集的详细分子机制不清楚，还有待于进一步研究。(Ahallys Pallas)蛇毒类凝血酶的研究.分离纯化及理化酶学性质的鉴定.生物化学与生物物理学报,1414(4):303-307.Li XB.2004.The research progress of 5-nucleo
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