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1、第一章植物细胞组培：在离体条件下利用人工培养基对植物器官、组织、细胞原生质体等进行培养，使其长成完整株体。类型 1器官培养 2茎尖分生组织培养3愈伤组织培养 4细胞培养 5原生质体培养植物组培特点:1培养条件可认为控制 2 生长周期短，繁殖率高 3管理方便，利用工厂化生产和自动化控制 植物细胞全能性：每个植物体细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，因此在一定条件下培养都可发育成一个与母体一样的植株。植物细胞变现全能性必须经过的步骤:成熟细胞分生细胞胚状体完整植株成熟细胞愈伤组织出根出芽完整植株愈伤组织:原本指植物受伤后在表面形成的一团薄壁细胞。植物组培中特指人工培养基上形成的无数生长的薄壁细
2、胞。脱分化：已经完全分化定型的细胞，经过诱导成为重新恢复分裂能力的细胞的过程。诱导细胞脱分化是处于抑制的，需要外接条件刺激，在各条件中，激素起重要作用。4类植物 1有些植物只需生长素IAA吲哚乙酸 NAA萘乙酸 2,4-D 如菊苣2 有些仅需细胞激动素 萝卜 大豆3 须加细胞激动素和生长素 烟草 胡萝卜 马铃薯4不需加任何激素 烟草愈伤组织再分化：植物成熟细胞经过脱分化后（形成愈伤组织后），由愈伤组织再形成完整植株的过程。植物组培过程 取组织形成愈伤组织幼胚植物幼体成熟植株 脱分化 再分化*以高度分化的动物体细胞的细胞核具有全能性植物组培动物组培原理植物细胞全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液
3、体培养基培养基特有成分蔗糖、植物生长调节剂葡萄糖、动物血清培养结果植物植株细胞系、细胞株培养目的快速繁殖、培育无病毒植株等获得细胞或细胞分泌物植物组培发展简史探索阶段 施莱登 施旺 创立细胞学说 提出理念细胞学说要点1动植物均由细胞组成2所有细胞来自其他细胞3卵和精子是细胞4单个细胞可分裂形成组织5细胞遗传全能性；组培技术哈勃兰特 成功培育出植物 提供理论基础奠基阶段 怀特 配制出培养基 认识到维生素和植株激素在植物组培中的重要作用崔徵 用不同种类和比例植物激素处理离体培养的烟草茎段和髓 发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一斯图尔特 证实哈波兰特50年前理论正确性快速发展阶段
4、 MS培养基 PEG原生质体融合法 植物遗传转化 体细胞无性系变异 人工种子植物组培应用1增加遗传变异性，改良作物2繁殖植物无性系：组培中从一个单细胞、一块愈伤组织、一个芽等器官都可获得无性系。无性系就是用植物体细胞繁殖所得的后代。植物组培的无性系5种原球茎 经原球茎形成植物 兰花愈伤发生型 细胞或愈伤组织 通过不定芽形成植株 烟草愈伤组织胚状体发生型 细胞或愈伤组织 通过胚状体 胡萝卜体细胞培养器官型 离体茎 花芽等直接产生小植株 百合无菌短枝扦插 腋芽，连同短枝经灭菌后 在无菌条件下培养，使其生根3有用化合物的工业化生产培养物低温贮藏和种质库的建立生物科学的发展三大成就 生苦克隆技术 基因
5、工程 干细胞技术植物基因工程技术发展对植物育种影响核心DNA重组技术 T-DNA转化原理 植物细胞全能性通过揭示T-DNA转化原理，改造Ti质粒并构建植物表达载体系统，诱导转基因细胞分化。发展最快领域。克隆 广义 一个细胞个体无性繁殖 产生的后代基因克隆 是指基于大肠埃希菌的DNA 片段（或基因）的扩增过程 目标DNA的获得、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖植物遗传转化：将外源基因转移到植物体内稳定的整合、表达与遗传的过程先决条件 建立稳定高效的转化体系主要方法 农杆菌法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 电击法 聚乙二醇法基因组学：最早指基因组作图和测序。后来经发展科
6、学家定义为研究生物基因组的结构和功能的科学。分为结构基因组学和功能基因组学两大部分。DNA分子标记 直接分子水平检测DNA差异 DNA水平上遗传变异的直接反应现在有数十种对植物育种影响 筛选分子标记，构建分子标记遗传图普，为植物育种，特别是数量性状遗传育种提供参考第二章基本设备：超净工作台植物组培用具 培养基配置用具烧杯 容量瓶 量筒 移液器培养用具试管 三角瓶 培养皿 封口膜接种用具酒精灯 镊子 喷雾器 解剖刀用具洗涤洗涤剂 酸洗 转基因废弃物必须灭菌用具灭菌干热灭菌 酒精灼烧 过滤 0.2um小型器具分注器 血球计数器 移液器 过滤灭菌器常用仪器酸度计 天平 磁力搅拌器 高压蒸锅灭菌器 干
7、燥灭菌箱 离心机 电冰箱 摇床 培养箱 显微镜培养室 洁净 培养架 植物生长专用灯 25 70%-80%湿度培养室和接种室灭菌 2%新杰尔敏擦洗 75%乙醇喷雾 UV照射20MIN（紫外）器皿和接种工具灭菌 解剖刀 镊子 剪刀等采用干热灭菌法 烘箱灭菌 120 1H外植体灭菌原则：充分灭菌 不损伤外植体 不同外植体灭菌要求不一样常用方法 75%乙醇（无毒 湿润植物） 氯化汞（有残毒） 次氯酸钠（无害）培养基灭菌方法 高温高压蒸汽灭菌 过滤灭菌 植物组织培养基 主要成分：水 无机成分 大量元素 N P K Ca（平衡体内离子）Mg S微量元素 铁 硼 猛 锌 铜 钼 钴 氯有机物质 硫胺素VB1
8、 盐酸吡哆醇VB6 烟酸VB3 泛酸钙VB5 肌醇Inositol（促进胚状体生成） 水解酪蛋白CH 水解乳蛋白LH 麦芽提取物ME 酵母浸出物YE碳源 作用：营养物质 控制渗透压 类型 蔗糖 果糖 山梨醇等浓度2%-5% 低的原生质体 高的胚和花药固化剂 琼脂用量7-10g 即0.7%-1% 对植物有用 少了培养基软 多了太硬 不同品牌对植物反应不同GELRITE脱乙酰吉兰糖胶 成分稳定培养基PH值5.56.06.0硬化 PH降低会产生有机酸影响N利用PH调整方法 1N HCL 或NAOH 在加入agar前先调节测定方法 PH试纸 PH计植物激素：生长素 细胞伸长 细胞分裂 诱导愈伤 促进生
9、根 IAA NAA 2,4D细胞分裂素：促进细胞分裂 激动素 玉米素 6-苄基腺嘌呤赤霉素 植物生长 开花 结果脱落酸 促进组织成熟 调节气孔开闭生长素 溶于95%乙醇溶液或0.1molNAOH KOH细胞分裂素 0.5或1molHCL 微热赤霉素 溶于水PH5.7不稳定 用95%乙醇溶解配比模式 生长素/细胞分裂素 高 有利于根形成和愈伤组织形成适中 有利于根芽的分化 低 有利于芽的形成一般用mg/l表示 生长素0.5-1细胞分裂素0.5-1MS培养基 广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好B5培养基 White培养基 N6培养基 小麦水稻 花药培养 KM-8P培养基 广泛用
10、于原生质融合的培养培养及选择和配制 MS最基本 高浓度N K NH4+具体参照实验外植体 外植体选取 基因型 草本木本 双子叶单子叶来源 茎尖等生长旺盛组织 幼嫩组织幼苗消毒剂分子式浓度时间/min消除毒性次氯酸钙10%5-30易次氯酸钠20%5-30易双氧水10-12%5-15易硝酸银1%5-30难氯化汞0.1-1%2-10难剧毒抗生素4-50mg/l30-60难酒精70-75%0.2-2易外植体培养 严格无菌条件外植体褐变 基因型，木本植物严重（丹宁酚类物质）部位及生理状态（幼嫩组织）表面消毒伤害培养基（无机盐浓度过高，激素使用不当）培养条件不合适外植体褐变预防 外植体选择及预处理（幼嫩组
11、织，预培养）适合的培养条件褐变抑制剂，吸附剂（VC 活性炭）培养条件温度25光照（暗培养，利于愈伤组织和细胞增殖）光照（器官分化需要光）通气（低氧利于体细胞胚发生，高氧利于生根）湿度（容器内是饱和的）继代培养 固体培养：一般4周继代一次 液体培养：一般1-2周继代一次培养所需环境光强 前期1000-4000lx 后期10000lx光照时间 不同的不同光质 一般采用日光灯温度 25第三章植物器官组培 建立在植物细胞全能性理论上，在植物组织器官水平开展研究 ，实现植物细胞全能性，完成植物生命周期的过程。分为营养器官和繁殖器官培养。愈伤组织的形成启动期 外界条件刺激下 蛋白质核酸合成代谢加强 生长素
12、的作用 细胞代谢变化：呼吸作用加强;多聚核糖体增加；蛋白质合成加快，酶活性加强。分裂期：细胞快速分裂 无特定结构 质地疏松分化期：分生组织瘤状结构及纤维组织的形成，不同组织形态颜色不同。愈伤组织分化与生长收对数期与指数期的影响。外植体到小植株形成过程腋芽萌发 侧芽雏哨，侧芽萌发，从芽。草莓快繁不定芽发生 芽原基及分生组织，大量不定芽，萌发成苗体细胞胚胎发生：胚性细胞分化，形成胚状体影响愈伤组织的主要因素外植体：被子裸子 双子叶单子叶 草本木本培养基：MS N6 NLN B5激素组合：高浓度生长素+低浓度细胞分裂素 利于诱导愈伤组织影响器官分化主要因素生长素/激动素作用模式：激动素导致芽的分化及
13、发育；生长素类抑制芽形成碳源的影响蔗糖2-3%，NLN 13-20% 麦芽糖 禾本科植物雄核发育诱导环境条件 光照：叶绿素形成 温度：25 接近自然换将 湿度：玻璃化现象*玻璃化现象叶片结构，叶绿体，气孔等细胞器差异导致玻璃苗组织结构和生理功能异常因此难分化、增殖、生根、移栽成活是组培中待解决的一大难题体细胞胚胎发生自然界植物胚胎发生：受精作用完成后始于合子的胚胎发生过程。体细胞胚胎发生，形成二倍体植株花粉胚胎发生，形成单倍体植株植物体细胞具有成胚能力特点 两极性 内部细胞分布不均 发育成根端芽端 基因表达产物分布不均形成的尽心梯度导致的结果遗传稳定性 胚状体源于细胞或细胞团 结构稳定 不会再
14、分化脱分化 个体变异小 遗传稳定次级胚状体 发生数量大 增殖率高生理隔离 体细胞与母体组织维管束系统无直接联系途径 直接途径 外植体-胚状体间接途径 外植体-愈伤组织-胚状体体细胞发生诱导机制（植物体细胞胚胎发生）：已分化的体细胞经激素诱导，再经过胚性细胞化过程，形成完整胚状体的过程影响体细胞胚胎发生的因素外植体遗传背景 胡萝卜柑橘易 烟草难 物种影响生理状态：生理年龄。幼年的易于启动植物激素：诱导蛋白质形成从而启动基因特定表达 细胞分裂素诱导蛋白质合成 促进mRNA合成，多核糖体的形成与活化脱落酸 促进成熟激素 促进体细胞胚胎正常发育乙烯 促进成熟和衰老的激素 抑制植物体细胞胚胎发生金属离子
15、 促进多氨合成 提高胚胎发生频率碳源及有机物 NH4+比NO3-利于胚胎诱导胚培养意义胚挽救 提高种子萌发率 打破种子休眠 克服株心胚干扰 诱导胚状体和胚性愈伤组织 种子生活力快速测定胚乳培养意义 被子植物 中央极核 精核 有研究价值 产生混倍体 非整倍体离体授粉：人工控制下是离体陪住完成授粉，受精形成种子的过程克服植物受精不育障碍胚珠试管受精 子房离体受精 雌蕊离体授粉 植物器官组织叶培养植物叶培养：以离体的植物叶片器官为外植体进行培养，再生植株的过程。培养过程：愈伤组织诱导；不定芽分化；无菌苗增殖及生根愈伤组织诱导：诱导接种的叶片脱分化形成愈伤组织的过程不定芽的分化：由脱分化的愈伤组织细胞
16、分化出不定芽和不定根的过程不定芽的增殖和生根：分化不定芽切下后接种于增值培养基中 促进不定芽增殖 之后产生的无根苗放于生根培养基中产生根植物器官组织培养根段培养以植物的根切段作为外植体培养，再生完整植株的过程。过程：愈伤组织诱导 不定芽分化 无菌苗的增殖与生根植物器官组织培养茎尖培养对植物的带有定芽或不定芽的外植体进行离体培养，再生完整植株的过程。快繁主要途径 易培养 变异小 性状均匀 繁殖速度快植物器官组织培养种子培养定义：对受精后发育不全的未成熟种子和发育完全的成熟种子进行离体培养的技术用途：打破种子休眠 缩短生活周期 挽救远缘杂种 提高杂种种子萌发率要求：成熟种子要求简单 未成熟种子需一
17、定的营养成分和生长调节剂人工种子：通过植物组培获得具有完整结构的植物胚状体 再用适当方法包裹起来 代替天然种子组成：胚状体 人工种皮 人工胚乳制备：胚状体的诱导与同步化人工种子的包埋人工胚乳的制作人工种皮的制作人工种子贮藏等步骤胚状体同步化或筛选：促使所有培养的细胞或发育中的细胞团块进入同一分裂时期 只有同步化才能成批产生成熟胚胎化学方法：饥饿法 阻断法物理方法：低温处理法 过滤筛选法 渗透压分离法 密度梯度离心法包埋：材料 海藻酸钠 液胶包埋法 干燥包裹法 水凝胶法人工种子有点 解决作物繁殖能力差等问题工业化生产 提高自动化程度有营养物 提高作物产量用其播种节约成本第四章植物细胞培养技术：在
18、细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行的一系列生物工艺学操作 包括分离、培养、再生等一系列相关操作就化合物生产来说，主要是无菌条件下通过悬浮培养植物细胞生产有用化合物的过程细胞培养：将植物单细胞或细胞团直接在培养基中进行培养的一种培养方式特点：操作简单 重复性好 群体大 用于突变体筛选 遗传转化 有用化合物生产单个植物细胞在液体培养下，可发生类似受精卵发育成胚的过程，然后再生成小植株。少数植物可以再愈伤组织上直接发育出花器官。器官发生和形态建成在试管培养中，通过植物激素配比调控实现。激动素KT 细胞分裂素6-BA诱导芽分化吲哚乙酸IAA诱导根发生因此可通过细胞培养研究植物器官发生和形态建成的调
19、控因素和发育机制单细胞分离机械法 机械研磨 过滤 低俗离心特点 无酶伤害 无需质壁分离 但不易获得大量细胞酶解法 利用细胞壁降解酶，出去植物细胞壁，获取原生质体常用的降解酶 纤维素酶 果胶酶 半纤维素酶 离析酶特点：可从几乎所有植物器官获取大量细胞酶制剂含核酸酶 蛋白质酶过氧化物酶 酚类物质 影响分离的原生质体活力蜗牛酶：是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，含纤维素酶，果胶酶，淀粉 酶，蛋白酶等20多种酶 很有价值 用于酵母细胞壁破碎 因此也用于细胞生物学和基因工程学研究由完整植物器官分离细胞机械法 酶解法由愈伤组织分离单细胞悬浮细胞液过滤 离心 酶解法单细胞培养 培养方法平板培养法：镶嵌于
20、0.6-1%琼脂培养基中看护培养法：利用生长的愈伤组织产生的物质培养单细胞微室培养法：人工制造微室，将单细胞培养与于少量培养基内，让其分裂成细胞团纸桥培养法：培养物不易干燥细胞悬浮培养：将游离的单细胞或细胞团按一定细胞密度悬浮于液体培养基中进行培养的方法。可用于工业化生产分批培养法：将一定量细胞或细胞团分散在一定量液体培养基内，建立单细胞培养物，一般用100-250毫升密闭的三角瓶。连续培养法：利用特质培养容器进行大规模细胞培养的方式。不断注入氧气与新鲜培养基，保持内部营养物质充分。培养基 不同物种使用不同培养基悬浮培养的震荡 愈伤组织破碎 分散气体交换培养中加CO2目的：植物能非光和固定CO
21、2 影响植物生长 在植物细胞培养中培养液充分混合的同时，氧气与CO2达到某一平衡，植物才能很好的生长细胞悬浮培养的同步化物理方法细胞或细胞团大小控制 环境条件控制化学法使细胞遭受特定营养饥饿（饥饿法、磷酸盐胁迫），或加入特定生化抑制剂组织细胞完成分裂周期（DNA合成抑制剂）细胞增殖测定细胞鲜重 细胞干重：60-80 烘干36-48H细胞密实体积：2000-4000rpm5min 密实体积/总体积细胞计数：血球板计数影响单细胞培养只要因素碳源 葡萄糖对细胞数 细胞团大小、干重增加最有效激素 生长素利于薄壁细胞生长细胞分裂素利于诱导细胞分裂，细胞数增加乙烯诱导细胞壁加厚。内源乙烯是产生旺盛分裂细胞
22、的特征，受生长素促进突变体筛选：从培养的植物细胞再生出来的新植株表现出高度的遗传变异，这种现象称为“体细胞的无性系变异”。可从这些变异系中选择有益农艺性状的作物。细胞突变体的诱变与筛选：在培养基中加NACL或加病原体的毒蛋白细胞水平上的筛选：以单个细胞为处理对象，经胚胎再生获得完整植株，得到单细胞起源体，稳定遗传的非嵌合体。一单个细胞为对象 节省空间 高效率选择诱变周期短，不受季节环境限制用生物化学方法筛选诱变体的有点：诱变数量大，诱变几率高。与种子 苗木 插条比，细胞水平的重复性、稳定性好突变体的主要应用为细胞杂交和基因导入提供选择记号(白化苗)用于遗传研究和代谢研究（拟南芥）对农作物性状进
23、行遗传改良有用化合物生产高产细胞系建立 愈伤组织诱导，愈伤组织特定结构 松脆 快速生长细胞大量培养发酵罐，生物反应器植物中含大量此代谢产物。可用于对抗疾病，但是自然生产慢，还收外部环境制约。人工栽培也不满足，因此提出工业化培养以提供人类需求药用植物此生代谢产物：药用植物体内一大类化合物，是细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必须小分子人参细胞培养：提取粗皂角苷 肉苁蓉：苯乙醇甙药用植物细胞培养技术次生产物代谢生产中，给予体外生长的植物细胞一定营养条件，使其生长，并根据植物生长条件来获取植物次生代谢产物的技术优点：可在完全人工控制下进行，一年四季均可生产通过改变培养条件增加植物产量在无菌条件下
24、进行，因此可排除病菌及虫害对药用植物的侵扰第五章原生质体的分离、培养和细胞杂交植物原生质体：脱去细胞壁裸露的、有生活力的原生质团特点：每个原生质体均含完整遗传信息，具有全能性遗传上同质性克服性细胞不亲核障碍，进行远缘体细胞杂交遗传转化理想受体原生质体培养：用酶消化细胞壁分离出原生质体，放入液体或固体培养基内，再生出细胞壁，并进行细胞分裂，生成愈伤组织，最后生成完整植株。原生质体分离植物细胞壁组成 纤维素（25-50%）半纤维素（53%）果胶质（5%）少量蛋白质纤维素酶和果胶酶是分离植物原生质体必要的酶。崩溃酶是一种综合酶，包括纤维素酶、果胶酶、地衣多糖酶、木聚糖酶的活性（同时具有）酶最适PH5
25、-6 温度40-50 考虑细胞承受力 一般25-30不可高压高温灭菌 须采用膜过滤0.22微米酶解条件一般几小时，不超过一天黑暗中，静止/轻摇叶片下表皮撕去负压原生质体提供 原生质体分离：双子叶单子叶双子叶植物原生质体分离 叶片为主 酶处理简单 可获得大量原生质体禾本植物 从胚性愈伤组织/悬浮细胞 原生质体火力强 可以持续分裂 保持较强器官分化能力组织学特征：细胞体积小 近圆形 细胞质浓厚 液泡不发达草本木本 幼嫩成熟获取原生质体材料天然材料：田间植物 盆栽植物培养材料：愈伤组织 悬浮培养细胞 试管无菌苗注意选择具有形态分化潜力的细胞易于得到大量原生质体原生质体稳定性好，不易破碎原生质体可持续
26、分裂基因型的差异制备原生质体的起始材料的特性和状态外植体来源的愈伤组织和悬浮液培养物，是植物原生质体研究中最广泛使用的原生质体来源的材料。原生质分离 片表面消毒 去除表皮 漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中 负压条件，原生质体沉到溶液底部 出去酶溶液 将原生质体移入清洗液，离心、清洗两次 重悬浮于养基 血球计计数、以合适密度重悬浮于培养基原生质体培养：经分离纯化的原生质体在适当培养基和培养条件下，很快开始细胞壁再生和细胞分裂（2-7天），进一段时间（2-3周），再培养基上出演肉眼可见的愈伤组织，转移到分化培养基上，诱导芽和根，再生植株原生质体活性试验胞质环流作为代谢活跃指标呼吸强度指标、光合活
27、性指标Evans指标FDA(荧光素双醋酸酯)培养基 KM8P原生质体分离后非常脆弱，需渗透压保护剂知道生成细胞壁针对不同研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素水平做适当调整培养方法液体基质培养法半液体基质培养法固体基质培养法原生质体分离培养的意义可摄入外援DNA 细胞器 细菌 病毒颗粒 这些特性与植物细胞全能性结合为高等植物遗传饰变打下基础获得无性系和选育突变体的优良起始材料体细胞杂交：体细胞完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法原生质体融合方法自发融合 不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连诱发融合（NANO3处理，高PH-高浓度CA离子处理，PEG处理，电融合）PEG融合：将两种不同原生
28、质体以一定比例混合，用28-58%溶液处理15-30min，之后将原生质体用培养基逐步清洗即可培养机理（不确定）：PEG分子有负极性，可与正极性的蛋白质，碳水化合物等形成氢键。当PEG分子量足够大时，在相邻原生质体表面可起到分子桥的作用，发生粘连有点：双核异核体形成频率高 重复性好 毒性低 无特异性电融合：将两种原生质体混合，在交变电流下，使原生质体沿电场方向排列形成串珠状，给以瞬间高强度电脉冲，是原生质体膜局部破损从而融合特点：融合快速，同步性好，大量融合，融合体含2-3个原生质体，无毒，仪器昂贵融合产物额培养：与原生质体培养相似。通常无法选择时，培养出植株再选择杂种细胞的选择系统细胞系互补
29、选择方法：叶绿素缺失互补，营养缺陷互补，抗性互补。每个亲本细胞贡献一个等位基因，纠正对方缺陷，是下一代更优良物理特异性选择：大小、颜色、漂浮密度依据生长特性差异：植株再生性，杂种优良生长体细胞杂种的鉴定：利用杂种植物与双亲表型差异分析。抗性性状指标经典细胞学鉴定法通过对染色体数目、形态等细胞学观察来鉴定分子细胞学鉴定法用NDA探针与染色体上DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术利用其特点进行检测同工酶鉴定法功能相同酶的多重分子形态，是特意基因产物。体细胞杂种内酶往往是双亲酶的总和，同时表现双方特有酶带，同时表现新生杂种带体细胞杂种的核型体细胞杂种染色体倍性水平变异可能由于原生质体自发
30、融合，或由供体细胞的细胞学状态造成的。培养细胞比原本细胞更易变异分子生物学鉴定法RFLPRAPDAFLPSSRSNP遗传特性共显性显性显性/共显性显性显性/共显性多态性低中等高高低检测基础分子杂交随机RCP转移PCR专一PCR专一PCR检测基因组部位单/低拷贝整个基因组整个基因组重复序列区整个基因组技术难度难 易易易易DNA含量高低低低低DNA用量5-10ug50ng50ng50ng暗培养），外植体生理状态（活跃生长的芽，顶芽效果比腋芽好）茎尖培养在育种中的应用:由于茎尖遗传稳定，茎尖培养技术成熟，多用于常规方法繁殖有困难的物种，杂合性以及有性不亲和基因与不育基因型的繁殖，新杂交种快繁，繁殖大
31、批遗传性状一致的亲本供大规模杂交制种。茎尖组织中的突变体筛选、多倍体、混倍体突变；物理射线处理，诱发突变体优点：培养方法简单，繁殖迅速，茎尖遗传性状稳定，易保持植株优良性状步骤：无菌培养的建立芽的诱导生根培养试管苗的移栽（遗传变种）茎尖组织培养的方法材料：带叶原基的茎尖 易于培养 成苗快 时间短 无病毒植株获得，理论上茎尖越小越好，0.1mm以下不带病毒。实际用时，切取0.1-1mm茎尖材料的消毒：表面消毒，无菌苗的使用茎尖组织的分离：解剖镜。茎尖越小，脱毒效果越好，越难分离培养基：MS培养基较适合，加适当细胞分裂素和生长素培养条件：25，光照利于茎尖培养无病毒植株的生产：种子快繁植株，由于种
32、子不带病毒，随植物世代交替除去病毒。马铃薯 大蒜 草莓 葡萄 兰花等生长受病毒影响大园艺作物连坐障碍严重，加重土传病毒危害，杀菌剂、抗生素无效热处理病毒：特定病毒人不稳定性，使病毒钝化，失活（播种前烫种）茎尖培养脱毒：茎尖分生组织尚未感染病毒重要愿意花卉采用此方法得到大量无毒苗。去除病毒后，植株生长势强，花朵变大，色泽鲜艳，抗逆性强产花数量上升，营养繁殖：茎尖组织培养可在严格控制和调解适宜的营养、激素、温度、光照等条件，使许多常规条件下难生长的和繁殖的植物材料顺利扩繁（兰花工业）植物离体繁殖技术：果树离体繁殖技术蔬菜离体繁殖技术观赏植物离体繁殖技术药材植物离体繁殖技术体细胞无性系的变异：变异来
33、源组织细胞培养中发生的：发生频率与培养时间成正比起始外植体预先存在变异的：嵌合体发生染色体数目变异 染色体结构变异雄核发育诱导植株中的倍性变异：多数为正常的二倍体和单倍体。也有多倍体，混倍体和各种非整倍体植株体细胞无性系变异应用：生化代谢途径的研究体细胞杂交的选择标志（硝酸还原酶缺陷突变体，不能有效利用硝酸盐。两个突变体的互补作用，产生的体细胞杂种恢复了硝酸还原酶活性）作物遗传改良：雄性不育突变体抗氨基酸及氨基酸类似物突变体耐盐突变体（大部分生理适应）抗除草剂突变体抗病突变体（利用病原分泌的毒素做培养基）种质离体保存：种质资源是遗传育种物质基础。种质保存是资源研究的基础。 利用天然或人工创造适
34、宜环境保存种质资源，使个体所含有的遗传物质保存遗传完整性，有高活力，能通过繁殖将遗传特性传递下去。植物种质资源离体保存是采用组织培养技术，保存已建立再生体系的植物细胞组织培养物，如单细胞、原生质体、愈伤组织、花粉、分生组织、愈伤苗等超低温保存：低于-80低温，主要指液氮（-196）及液氮蒸汽条件超低温保存特点：活物质的代谢及生长完全停止保持生物材料遗传完整性保持生物材料形态发生潜能，细胞形态发生能力避免积累性突变的发生保存不稳定性培养物，如单细胞去病毒种质的保存，防种质衰老延长花粉寿命，解决杂交困难抗旱新材料的突变筛选便于种质交换；基本建设投资较小超低温保存原理：降温冷冻和化冻过程易引起植物伤
35、害。细胞内结冰（冰晶刺破细胞膜）细胞内溶质的浓缩（细胞脱水）防冻剂的使用：二甲基亚砜 聚乙二醇 甘油提高溶液粘滞性，降低冰晶形成和增长速度增加细胞膜透性，防止细胞内结冰减少组织内溶质浓度的升高超低温保存的方法:材料预备预处理（低温锻炼）加入冷冻保护剂冷冻种植保存（-196度）快速解冻（34-40度）再培养常规低温保存 一般的程序玻璃化超低温保存 生物材料经高浓度玻璃化保护剂处理 快速投入液氮 不会造成机械损伤或溶液效应，伤害组织和细胞包埋脱水法超低温保存：将包含有样品的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶液，生成褐藻酸钙颗粒，辅以高浓度蔗糖预处理样品，使样品获得高抗冻力和抗脱水力 再冷冻干燥冷冻法超低温保存
36、：快速冷冻保存法。干燥处理 适度脱水 通过控制脱水速度和程度的方法加强植物抗冻性超低温保存材料类型：芽尖及茎尖分生组织幼胚及胚状体悬浮培养细胞及愈伤组织原生质体花粉低温保存（又称最小生长法）三种温度范围：20-30 0-15 -80-0减缓植物生长的方法：改良培养基中营养物质浓度（饥饿法）提高培养基渗透压（加入甘露醇）培养基中加入生长抑制剂低压保存（低气压，低氧压）干燥保存（适当干燥失水，减缓生长）第八章植物遗传转化：将外源基因转移到植物体内稳定的整合表达与遗传的过程。（建立稳定高效转化体系是先决条件）根据基因转化技术原理将转基因技术分为：以质粒DNA等为载体的转化系统不用任何载体，通过物理化
37、学方法直接将外援基因导入受体细胞的直接转化系统以植物自身生殖系统种质细胞为媒体的转化系统主要方法：农杆菌法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 电击法 聚乙二醇法农杆菌介导基因转化原理：农杆菌是革兰氏阴性菌，与植物赚到有关的有：根癌农杆菌，含Ti细胞，诱导植物形成肿瘤，发根农杆菌，含Ri细胞，诱导植物产生毛发状根Ti质粒和Ri质粒是植物基因转化理想载体。植物基因转化必须有质粒上的T-DNA和vir基因即毒性区两部分的参加T-DNA：T-DNA携带的基因编码产物能促进生长素和细胞分裂素合成，导致转化植物冠瘿瘤形成，在此过程中，T-DNA转移到植物细胞并整合到染色体基因组T-DNA重要T-区两端有
38、25bp重复序列。14bp为中心，分为10bp和4bp，是完全保守的。这两个边界是T-DNA转移所必须的。T-DNA整合到植物基因组中后可向后代传递，基本保持T-DNA整合部位稳定性，遵循孟德尔遗传定律Vir基因Vir基因染色体包含Ch2va、ChvB、att、pscA、ChvD、ChvB，大多编码膜相关蛋白，负责使细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上Ti质粒的vir区大小30Kb分virA,B,C,D,E,G,H等7个操纵子。共有24个基因共同控制T-DNA加工和转移。总称调控子Vir基因活化转录实在接受了植物细胞产生的 创伤信号分子后才开始具体过程：活化农杆菌介导基因转
39、化的载体系统双载体系统将Ti质粒分成穿梭载体和辅助质粒辅助质粒永久存在于农杆菌寄主内，携带有病毒基因穿梭载体非常小并含有T-DNA边界序列，能在广泛寄主细胞内复制，同时具有抗生素抗性标记和作为外源基因整合的多个位点共整合载体系统:Ti基因上编码致瘤基因的序列被一段pBR322DNA所取代，带外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后，二者相同的pBR322序列发生同源重组，外源基因就此整合到disarmedTi质粒上农杆菌介导基因转化方法含质粒的农杆菌与培养的植物细胞或受伤植物组织共培养植物细胞在选择培养基内增殖改变生长培养基内激动素和细胞分裂素的水平是转化细胞分化成转基因植株基
40、因枪法：利用一种仿枪结构的装置将表面吸附有外援基因的金属颗粒直接射入受体细胞，其表面依附的基因也随之进入受体细胞，是目前将外源DNA导入完整植物组织或原生质体的一种有效的技术优点:能应用于任何完整植物组织或植物细胞的区域 可以将任何DNA片段用于转化程序中 缺点：整合过程中DNA片段可能会随机丢失微注射法：将外源基因经剪切制备成一定浓度的DNA溶液，装入一个带注射器的玻璃微针内，将DNA直接注射到固定好的单个活细胞内。随细胞的发育，部分外源DNA随机整合到受体植物基因组内，经适当的筛选就可得到转基因植株缺点：被注射细胞数量少，优点：每个被注射细胞内DNA插入成功率较高花粉管通道法：利用开花植物
41、授粉后形成的花粉管通道，直接将外源DNA导入，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，实现目的基因的转移选择植物整体为受体 省略组织培养及继代等培养过程，排除植物再生障碍 因为转化的是完整植物的细胞，导入的DNA易整合，进入受体基因组的是部分DNA片段或目的基因。专控基因所控性状稳定，节约育种时间。抗虫基因的研究：抗虫育种中应用较多的为来源于细菌的Bt杀虫晶体蛋白基因来源于植物的蛋白酶抑制剂(PT)基因植物凝集素基因转Bt杀虫晶体蛋白基因：苏云金芽孢杆菌毒素蛋白（ICP） 平时 原毒素 无活性 昆虫取食后ICP全部或部分嵌合于细胞膜中，使细胞膜产生一些孔道，从而导致细胞渗透平衡的破坏，最终导致昆虫幼虫的死亡转蛋白酶基因抑制剂 植物天然抗虫蛋白质 导致蛋白质不能被昆虫正常消化CpTI 来自豇豆 抗虫效果好 抗虫谱广 胰蛋白酶抑制剂基因植物凝集素基因 影响营养的吸收，抑制害虫的生长发育繁殖。应用较多的为雪花莲凝集素（GNA）基因抗病转基因研究：导入病毒外壳基因（CP）利用病毒卫星RNA利用植物本身编码的抗病毒基因利用病毒反义RNA技术利用病毒复制酶基因应用最多的