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1、第二章菌种选育1第1页，共127页，编辑于2022年，星期三第一节第一节 菌种的分离简介菌种的分离简介 一、菌种的来源一、菌种的来源根根据据资资料料直直接接向向有有关关科科研研单单位位、高高等等院院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。教材教材教材教材P30P302第2页，共127页，编辑于2022年，星期三二、分离思路二、分离思路 新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种筛筛选选方方法法，快快速速
2、、准准确确地地把所需要的菌种挑选出来。把所需要的菌种挑选出来。实实验验室室或或生生产产用用菌菌种种若若不不慎慎污污染染了了杂杂菌菌，也也必必须须重重新新进行分离纯化。进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。先进的设备与之配合。3第3页，共127页，编辑于2022年，星期三定定方方案案：首首先先要要查查阅阅资资料料，了了解解所所需需菌菌种种的的生生长长培培养养特性。特性。采样：采样：有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。增增殖殖：人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培养养条条件件，使使所所需需菌种增殖培养后，在
3、数量上占优势。菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。发发酵酵性性能能测测定定：进进行行生生产产性性能能测测定定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产量量、耐耐受受最最高高温温度度、生生长长和和发发酵最适温度、酵最适温度、最适最适pH值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤4第4页，共127页，编辑于2022年，星期三菌种筛选主要步骤菌种筛选主要步骤调查研究及查阅充分的资料调查研究及查阅充分的资料 设计实验
4、方案设计实验方案 确定采集样品的生态环境确定采集样品的生态环境 采样采样 确定特定的增殖条件确定特定的增殖条件 增殖培养增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法定性或半定量快速检出法 平板平板分离 5第5页，共127页，编辑于2022年，星期三原种斜面原种斜面 确定发酵培养基础条件确定发酵培养基础条件 筛选筛选 初筛（初筛（1株株1瓶）瓶）复筛（复筛（1株株35瓶）瓶）结合初步工艺条件摸索结合初步工艺条件摸索 再复筛（再复筛（1株株35瓶）瓶）35株株 单株纯种单株纯种分离 生产性能试验生产性能试验 毒性试验毒性试验菌种鉴定菌种鉴定6第6页，共
5、127页，编辑于2022年，星期三（一）采样一）采样1、采样对象、采样对象 以采集土壤为主。以采集土壤为主。一一般般园园田田土土和和耕耕作作过过的的沼沼泽泽土土中中，以以细细菌菌和和放放线线菌菌为为主主；富富含含碳碳水水化化合合物物的的土土壤壤和和沼沼泽泽地地中中，酵酵母母和和霉霉菌菌较较多多，如如一一些野果生长区和果园内。些野果生长区和果园内。采采样样的的对对象象也也可可以以是是植植物物，腐腐败败物物品品，某些水域等。某些水域等。7第7页，共127页，编辑于2022年，星期三从自然界筛选从自然界筛选8第8页，共127页，编辑于2022年，星期三2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。、
6、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采采土土方方式式：在在选选好好适适当当地地点点后后，用用小小铲铲子子除除去去表表土土，取取离离地地面面5-15cm处处的的土土约约10g，盛盛入入清清洁洁的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中，扎扎好好，标标记记，记记录录采采样样时时间间、地地点点、环环境境条条件件等等，以以备备查查考考。为为了了使使土土样样中中微微生生物物的的数数量量和和类类型型尽尽少少变变化化，宜宜将将样样品品逐逐步步分分批批寄寄回回，以以便便及时分离。及时分离。9第9页，共127页，编辑于2022年，星期三（二）增殖培养（二）增殖培养 所所谓谓增增殖殖培培养养就就是是给给混
7、混合合菌菌群群提提供供一一些些有有利利于于所所需需菌菌株株生生长长或或不不利利于于其其他他菌菌型型生生长长的的条条件件，以以促促使使目目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择择性性培培养养基基，选选择择一一定的培养条件来控制。定的培养条件来控制。例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选选定定糖糖，淀淀粉粉、纤纤维维素素，或或者者石石油油等等，以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利
8、利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰。这这样样对对下下阶阶段段的的纯种分离就会顺利得多。纯种分离就会顺利得多。10第10页，共127页，编辑于2022年，星期三（三）培养分离（三）培养分离 尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离，纯纯化化。在在这这步步，增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用，而而且且控控制制得得细细一一点点，好好一一点点。纯纯种种分分离离的的方法有
9、划线分离法、稀释分离法。方法有划线分离法、稀释分离法。11第11页，共127页，编辑于2022年，星期三1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释12第12页，共127页，编辑于2022年，星期三1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法倾注平皿分离法13第13页，共127页，编辑于2022年，星期三2.平皿划线分离法 a.分区划线分离法 b.连续划线分离法14第14页，共127页，编辑于2022年，星期三（四）筛（四）筛 选选 这这一
10、一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，以以求求得得适适合合于于工工业业生生产产用用菌种。菌种。15第15页，共127页，编辑于2022年，星期三（五）毒性试验（五）毒性试验 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种，更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯
11、枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，其其他他微微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。16第16页，共127页，编辑于2022年，星期三第二节第二节 培养分离培养分离 从从自自然然界界中中分分离离培培养养微微生生物物是是菌菌种种选选育育的重要和基础的步骤。的重要和基础的步骤。到到目目前前为为止止，还还没没有有一一种种分分离离培培养养方方法法能能揭揭示示一一个个试试样样中中所所包包含含的的所所有有微微生生物物总总数和种类。数和种类。在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特特定定种种类类的的
12、菌菌株株；在在工工业业微微生生物物筛筛选选过过程程中中，应应及及时时调调整整检检测测方方法法，以以与与各各种种不不同同类型的生长和代谢之微生物相适应。类型的生长和代谢之微生物相适应。17第17页，共127页，编辑于2022年，星期三一、成功的分离培养方法一、成功的分离培养方法(1)认真考查所需产品的特征和生产过程；认真考查所需产品的特征和生产过程；(2)制订初步的筛选标准；制订初步的筛选标准；(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。将生态学方法运用到分离和筛选过程。18第18页，共127页，编辑于2022年，星期三二、将二、将生态学生态学方法用于培养分离的一方法用于培养分离的一般思路要点般思路
13、要点1罗列出所要分离的微生物类群；罗列出所要分离的微生物类群；2根根据据所所采采集集样样本本的的各各种种生生态态参参数数，描描述述所所要要分分离离的的微微生物之生态系统或栖息地：生物之生态系统或栖息地：3将将若若干干样样本本分分成成若若干干类类型型，如如植植物物和和植植物物各各部部，土土壤壤(类型和土层类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；、岩石、水、昆虫和发酵食品等；4罗罗列列出出所所要要考考察察和和测测量量的的环环境境参参数数，如如pH、盐盐分、水分、氧化还原电势及温度等；分、水分、氧化还原电势及温度等；19第19页，共127页，编辑于2022年，星期三 5列出生物系统中有用的自然底物
14、，如森林土壤列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；中的几丁质、葡萄表皮的果胶；6根据上述根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；和培养条件；7用标准方法作对照来评价生态学分离方法；用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；法；9运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。的微生物类群。20第20
15、页，共127页，编辑于2022年，星期三三、自然界中细菌的分离三、自然界中细菌的分离21第21页，共127页，编辑于2022年，星期三(一一)采样和采集方法采样和采集方法为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中中出出现现的的菌菌群群时，必须十分重视样本的采集。时，必须十分重视样本的采集。样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子子、解解剖剖刀刀、手手套套、无无菌菌小小塑塑料料袋袋和和塑塑料瓶等。料瓶等。三、自然界中细菌的
16、分离三、自然界中细菌的分离22第22页，共127页，编辑于2022年，星期三采样的注意事项采样的注意事项1 1、采样时应尽可能保持、采样时应尽可能保持相对无菌相对无菌；2 2、所采集的、所采集的样本必须具有某种代表性样本必须具有某种代表性；3 3、采采好好的的样样必必须须完完整整地地标标上上样样本本的的种种类类及及采采集集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4 4、应应充充分分考考虑虑采采样样的的季季节节性性和和时时间间因因素素，因因为为真真正正的原地菌群的出现可能是短暂的；的原地菌群的出现可能是短暂的；三、自然界中细菌的分离三、自然界中细菌的分
17、离23第23页，共127页，编辑于2022年，星期三5 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于44下，但贮存时间不宜过长。下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长体之间就会出现消长三、自然界中细菌的分离三、自然界中细菌的分离采样的注意事项采样的注意事项24第24页，共127页，编辑于2022年，星期三(二二)生态学参数及培养基的组成原则生态学参数
18、及培养基的组成原则1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以及及用用于于平平板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都都会会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就就分分离离培培养养基基的的组组成成而而言言，必必须须含含有有10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，应应含含有有多多种种碳碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。氮源，如几丁质、纤维素或果胶。三、自然界中细菌的分离三、自然界中细菌的分离25第25页，共127页，编辑于2022年，
19、星期三3、所有、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和如放线菌酮和制霉素制霉素)，掺加浓度一般为掺加浓度一般为50gm1，以抑制真菌以抑制真菌的生长。的生长。4、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育培养箱中孵育l、2天。天。5、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。到与试样的生态系统参数值相近。三、自然界中细菌的分离三、自然界中细菌的分离(二二)生态学参数及培养基的组成原则生态学参数及培养基的组成原则26第26页，共127页，编辑于2022年，星期三（三）
20、分离（三）分离目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速，有一目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。定准确性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应常用平皿反应法法：纸片培养显色法纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。：浸有指示剂滤纸。透明圈法透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。淀粉、碳酸钙等。变色圈法变色圈法：直接用显色剂或指示剂。：直接用显色剂或指示剂。生长圈法生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件作为工具菌，要分离
21、的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。生长圈。抑制圈法抑制圈法：琼脂块培养法。：琼脂块培养法。三、自然界中细菌的分离三、自然界中细菌的分离27第27页，共127页，编辑于2022年，星期三用刚果红染色法鉴定筛选降用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株解纤维素的菌株 羧甲基纤维素钠作培养物羧甲基纤维素钠作培养物28第28页，共127页，编辑于2022年，星期三29第29页，共127页，编辑于2022年，星期三四、放线菌的分离培养基的组成原则四、放线菌的分离培养基的组成原则大大多多数数放放线线菌菌的的分分离离培培养养是是
22、在在贫贫脊脊或或复复杂杂底底物物的的琼琼脂脂平平板板上上进进行行的的。除除嗜嗜温温性性放放线线菌菌外外，其其他他放放线线菌菌一一般般在在培培养养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。天内在分离平板上缓慢形成菌落。在在放放线线菌菌分分离离琼琼脂脂中中通通常常都都加加入入抗抗真真菌菌剂剂制制霉霉菌菌素素或或放线菌酮放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。，以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。选择性地添加抗生素。分分离离琼琼脂脂平平板板制制备备好好后后，一一般般皆皆应应在在37培培养养箱箱中中存存放放3天天。30第30页，共127页，编辑于2022年，星期三放线菌的分离放线菌的分离土样中放线菌的非选择性分离土
23、样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌的分离植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织无菌取植物组织，干燥干燥以减少细以减少细菌数量，菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养微生物后振荡培养。水中放线菌的分离水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布积进行系列稀释和涂布。3
24、1第31页，共127页，编辑于2022年，星期三次代培养及纯化次代培养及纯化菌菌落落形形成成后后可可根根据据肉肉眼眼可可见见的的菌菌落落形形态态上上的的差差异异，作初步的鉴定和区分。作初步的鉴定和区分。通通过过高高倍倍放放大大进进行行镜镜检检，可可了了解解气气生生和和营营养养孢孢子子形形成成情况。情况。成成功功地地分分离离出出各各种种不不同同的的放放线线菌菌属属及及种种的的关关键键是是所所采采集集样样本本的的本本身身及及其其分分离离用用的的琼琼脂脂培培养养基基；而而肉肉眼眼识识别别不不同同的的生生长长形形态态、从从而而初初步步地地加加以以鉴鉴定定，在在分分离离放放线线菌菌时时显显得得尤为重要。
25、尤为重要。将将分分离离平平板板上上所所形形成成的的菌菌落落用用经经火火焰焰灼灼烧烧灭灭菌菌的的钩钩形形针针或或无无菌菌牙牙签签挑挑取取，点点接接到到琼琼脂脂平平板板上上进进行行影影印印培培养养，以以进一步筛选和分离。进一步筛选和分离。放线菌的分离放线菌的分离32第32页，共127页，编辑于2022年，星期三放线菌菌落形态33第33页，共127页，编辑于2022年，星期三五五、真菌分离、真菌分离1 1、利利用用低低碳碳氮氮比比的的培培养养基基可可使使真真菌菌生生长长菌菌落落分分散散，利利于于计计数数，分分离离和和鉴鉴定定。这这里里主主要要是是利利用用营营养养成成分分的的减减少少而而使使生生长长减
26、减慢慢，并并由由此此限限制制真真菌菌的的迁迁徙徙生长。生长。2 2、改变培养温度改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。将有利于不同嗜温区真菌的分离。3 3、有有时时，真真菌菌子子实实体体形形成成必必须须有有光光线线，这这在在分分离离培养时应加以考虑。培养时应加以考虑。34第34页，共127页，编辑于2022年，星期三4、选择性富集选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也
27、可以是组成群水平的，如以纤富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、在分离培养基中加入一定的抗生素在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。细菌生长及菌落形成。五、真菌分离五、真菌分离35第35页，共127页，编辑于2022年，星期三真菌的分离方法真菌的分离方法土土中中真真菌菌的的分分离离：稀稀释释法法，压压贴贴法法,注注射射器器采采集集法法，土土过筛法。过筛法。植植物物材材料料中中真真菌菌的的分分离离
28、：植植入入法法，压压贴贴法法，洗洗涤涤法，浸泡法。法，浸泡法。水水中中真真菌菌的的分分离离：水水样样稀稀释释后后涂涂布布分分离离。诱诱饵饵技技术术常常用于水中真菌的富集。用于水中真菌的富集。教材教材教材教材P32P32五五、真菌分离、真菌分离36第36页，共127页，编辑于2022年，星期三六、生产选种六、生产选种 是是在在长长年年累累月月的的生生产产实实践践中中，在在培培养养工工艺艺条条件件没没有有任任何何可可见见变变更更情情况况下下，突突然然发发现现某某些些批批次次生生产产水水平平提提高高较较大大，这这就就有有可可能能是是个个别别自自然然变变异异朝朝更更好好的的方方向向变变的的细细胞胞，在
29、在这这种种条条件件下下很很适适应应于于培培养养条条件件，并并逐逐渐渐显显示示出出它它的的生生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。37第37页，共127页，编辑于2022年，星期三第三节第三节 工业微生物育种工业微生物育种2.3.1 工业化菌种的要求工业化菌种的要求2.3.2 已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍2.3.3 工业微生物育种简介工业微生物育种简介2.3.4 诱变育种诱变育种2.3.5 营养缺陷型的选育营养缺陷型的选育2.3.6 原生质体育种原生质体育种38第38页，共127页，编辑于2022年，星期三工业化
30、菌种的要求q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物q 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）q 生产特性要符合工艺要求第三节第三节 工业微生物育种工业微生物育种39第39页，共127页，编辑于2022年，星期三放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：已工业化产品生产菌的介绍第三节第三节 工业微生物育
31、种工业微生物育种40第40页，共127页，编辑于2022年，星期三二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：已工业化产品生产菌的介绍第三节第三节 工业微生物育种工业微生物育种41第41页，共127页，编辑于2022年，星期三HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节和异亮氨酸的合成调节机制机制 HT:高丝氨
32、酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶42第42页，共127页，编辑于2022年，星期三氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌43第43页，共127页，编辑于2022年，星期三三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌已工业化产品
33、生产菌的介绍第三节第三节 工业微生物育种工业微生物育种44第44页，共127页，编辑于2022年，星期三第三节第三节 工业微生物育种工业微生物育种工业菌种的育种：工业菌种的育种：是是运运用用遗遗传传学学原原理理和和技技术术对对某某个个用用于于特特定定生生物物技技术术目目的的的的菌菌株株进进行行的的多多方方位位的的改改造造。通通过过改改造造，可可使使现现存存的的优优良良性性状状强强化化，或或去去除除不不良良性性质质或或增增加加新的性状。新的性状。45第45页，共127页，编辑于2022年，星期三工业菌种育种的方法工业菌种育种的方法诱变诱变基因转移基因转移基因重组基因重组46第46页，共127页，
34、编辑于2022年，星期三育种过程育种过程包括下列包括下列3个步骤：个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模包括实验规模和工业生产规模)。47第47页，共127页，编辑于2022年，星期三选择育种方法时综合考虑的因素选择育种方法时综合考虑的因素 (1)待待改改良良性性状状的的本本质质及及与与发发酵酵工工艺艺的的关关系系(如如批批式式或或连续发酵试验连续发酵试验)；(2)对对这这一一特特定定菌菌种种的的遗遗传传和和生生物物化化学学方方
35、面面认认识识的的明明了了程度；程度；(3)经济费用。经济费用。如如果果对对特特定定菌菌种种的的基基本本性性状状及及其其工工艺艺知知晓晓甚甚少少，则则多多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如如果果对对其其遗遗传传及及生生物物化化学学方方面面的的性性状状已已有有较较深深的的认认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。48第48页，共127页，编辑于2022年，星期三工业菌种改良方法工业菌种改良方法(1)解解除除或或绕绕过过代代谢谢途途径径中中的的限限速速步步骤骤：通通过过增增加加特特定定基基因因的的拷拷贝贝数数或或增增加加相
36、相应应基基因因的的表表达达能能力力来来提提高高限限速速酶酶的的含含量量；在在代代谢谢途途径径中中引引伸伸出出新新的的代代谢谢步步骤骤，由由此此提提供一个旁路代谢途径。供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。增加前体物的浓度。(3)改改变变代代谢谢途途径径，减减少少无无用用副副产产品品的的生生成成以以及及提提高高菌菌种种对对高高浓浓度度的的有有潜潜在在毒毒性性的的底底物物、前前体体或或产产品品的的耐受力。耐受力。49第49页，共127页，编辑于2022年，星期三(4)(4)抑制或消除产品分解酶。抑制或消除产品分解酶。(5)(5)改进菌种外泌产品的能力。改进菌种外泌产品的能力。(6)(6)消消
37、除除代代谢谢产产品品的的反反馈馈抑抑制制。如如诱诱导导代代谢谢产产品品的的结构类似物抗性。结构类似物抗性。工业菌种改良方法工业菌种改良方法50第50页，共127页，编辑于2022年，星期三 改进菌种的生长效率改进菌种的生长效率提高菌株对底物的利用率方法：提高菌株对底物的利用率方法：a.通过确定并改变代谢中的耗能部分通过确定并改变代谢中的耗能部分;b.赋赋予予菌菌种种对对多多种种底底物物，特特别别是是价价廉廉而而丰丰富富的的底物的利用能力，由此可降低操作费用。底物的利用能力，由此可降低操作费用。51第51页，共127页，编辑于2022年，星期三2.3.4 2.3.4 诱变育种诱变育种以以微微生生
38、物物的的自自然然变变异异作作为为基基础础的的生生产产选选种种的的机机率率并并不不很很高高，一一个个基基因因的的自自然然突突变变频频率率仅仅10-6-10-10左右。左右。诱诱变变育育种种：以以诱诱发发突突变变为为基基础础的的育育种种，是是迄迄今今为为止止国国内外提高菌种产量、性能的主要手段。内外提高菌种产量、性能的主要手段。教材教材教材教材P37P3752第52页，共127页，编辑于2022年，星期三诱变物理、化学或生物诱变方法物理、化学或生物诱变方法53第53页，共127页，编辑于2022年，星期三 一、诱变剂和诱变处理 物物理理诱诱变变剂剂：射射线线如如紫紫外外线线、X射射线线、射射线线，
39、快中子；快中子；物物理理因因素素中中目目前前使使用用得得最最方方便便而而且且十十分分有有效效的的是是紫紫外外线线。许许多多高高产产菌菌株株的的选选育育都都用用过过紫紫外外线线，对对于于一一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其其他他的的几几种种射射线线都都是是电电离离性性质质的的，有有一一定定的的穿穿透透力力，一一般般都都由由专专业业人人员员在在专专门门的的设设备备中中使使用用，否否则则有有一一定危险性。定危险性。教材教材教材教材P40P4054第54页，共127页，编辑于2022年，星期三超净工作台超净工作台小型小型X射线衍射仪射线衍射仪Co60射线机
40、55第55页，共127页，编辑于2022年，星期三化学诱变剂：化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、化学因子如碱基类似物、5 5氟尿嘧啶、烷化剂等。氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点使用化学诱变剂的优缺点：1 1、大大多多数数情情况况下下，就就突突变变数数量量而而言言，要要比比电电离离辐辐射射更更有有效。效。56第56页，共127页，编辑于2022年，星期三2 2、化化学学诱诱变变剂剂是是很很经经济济的的，因因为为只只需需要要少少量量的的合合适适的的诱诱变变剂剂，设设备备是是实实验验室室的的一一般般玻玻璃璃器器皿
41、皿，一一个个蒸蒸气气罩罩。而而用用电电离离辐辐射射工工作作时时，设设备备费费用用大大，并并要注意安全性。要注意安全性。3 3、大大部部分分诱诱变变剂剂是是致致癌癌剂剂，所所以以在在使使用用中中必必须须非非常常谨谨慎慎，要要避避免免化化学学诱诱变变剂剂与与皮皮肤肤接接触触，且且切切勿勿吸吸入入其其蒸蒸气气，有有人人对对某某些些诱诱变变剂剂极极其其敏敏感感，甚甚至至未未直直接接接接触就会过敏，这就更要当心。触就会过敏，这就更要当心。使用化学诱变剂的优缺点：使用化学诱变剂的优缺点：57第57页，共127页，编辑于2022年，星期三诱变剂的选择诱变剂的选择1 1碱碱基基类类似似物物和和羟羟胺胺具具有有
42、很很高高的的特特异异性性，但但很很少少使使用用，回回复突变率高，效果不大。复突变率高，效果不大。2 2亚亚硝硝酸酸和和烷烷化化剂剂应应用用的的范范围围较较广广，造造成成的的遗遗传传损损伤伤较较多多。其其中中亚亚硝硝基基胍胍和和甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯常常被被称称为为“超超诱诱变变剂剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。58第58页，共127页，编辑于2022年，星期三3 3吖吖啶啶类类诱诱变变剂剂可可以以造造成成生生化化代代谢谢途途径径的的完完全全中中断。断。4 4紫紫外外线线仍仍十十分分有有效效。电电离离辐辐射射是是造造成成染染色色体体巨巨大大损损伤伤
43、的的最最好好诱诱变变剂剂，它它能能造造成成不不可可回回复复的的缺缺突突变变。但但它它可可能影响邻近基因的性能。能影响邻近基因的性能。诱变剂的选择诱变剂的选择59第59页，共127页，编辑于2022年，星期三空间诱变空间诱变近近年年来来用用宇宇宙宙系系列列生生物物卫卫星星、科科学学返返回回卫卫星星、空空间间站站及及航航天天飞飞机机等等空空间间飞飞行行器器,进进行行搭搭载载微微生生物物材材料料的的空空间间诱诱变变育育种种是是培养新的生物菌种的一种有效方法培养新的生物菌种的一种有效方法.近年空间诱变的研究进展迅速近年空间诱变的研究进展迅速,已涉及到已涉及到形态学、细胞学、生理生化、分子生物形态学、细
44、胞学、生理生化、分子生物学等领域。并开始进行地面模拟失重实学等领域。并开始进行地面模拟失重实验。验。60第60页，共127页，编辑于2022年，星期三空间诱变空间诱变空间环境的主要特征空间环境的主要特征为微重力、空间辐射、超真空为微重力、空间辐射、超真空和超净环境等。和超净环境等。一般认为空间诱变的主要因素有以下几个方面：一般认为空间诱变的主要因素有以下几个方面：微重力微重力。影响细胞分裂细胞运动、细胞间信息传。影响细胞分裂细胞运动、细胞间信息传递、光合作用和生长发育等生理生化过程。引起递、光合作用和生长发育等生理生化过程。引起遗传物质的改变。遗传物质的改变。微重力通过提高生物对诱变剂的敏感性
45、和抑制微重力通过提高生物对诱变剂的敏感性和抑制DNA 损伤的修复，加剧生物损伤并提高变异率。损伤的修复，加剧生物损伤并提高变异率。61第61页，共127页，编辑于2022年，星期三空间诱变空间诱变一般认为空间诱变的主要因素有以下几一般认为空间诱变的主要因素有以下几个方面：个方面：太空辐射太空辐射空间诱变与地面辐射处理发生的变异情空间诱变与地面辐射处理发生的变异情况有许多类似之处，况有许多类似之处，辐射敏化剂预处理辐射敏化剂预处理能增加生物损伤。能增加生物损伤。62第62页，共127页，编辑于2022年，星期三空间诱变空间诱变卫星中微生物生长的情卫星中微生物生长的情况况某种链霉菌搭载后其菌落生长
46、加快（比某种链霉菌搭载后其菌落生长加快（比地面对照快地面对照快6 倍）倍）悬浮生长的微生物细胞在空间与在地面悬浮生长的微生物细胞在空间与在地面以不同的速度繁殖。以不同的速度繁殖。微重力可以使许多微生物生长加快微重力可以使许多微生物生长加快1 倍以倍以上。因为在微重力条件下，空气中的氧上。因为在微重力条件下，空气中的氧可以均匀地供给细菌应用。这表明了在可以均匀地供给细菌应用。这表明了在空间生产生物制品的优越性。空间生产生物制品的优越性。63第63页，共127页，编辑于2022年，星期三空间诱变空间诱变真空度的提高会导致孢子突变频率的提真空度的提高会导致孢子突变频率的提高，但对质粒高，但对质粒DN
47、A无影响。宇宙射线会无影响。宇宙射线会导致导致DNA链的断裂而促使生物发生突变。链的断裂而促使生物发生突变。64第64页，共127页，编辑于2022年，星期三神七：神七：清华大学搭载了新型生物材料、生物燃料、医药和食品的重要微清华大学搭载了新型生物材料、生物燃料、医药和食品的重要微生物菌种，主要用于生物菌种，主要用于“工业生物技术工业生物技术”研究领域。研究领域。中国科学院搭载了用于空间生命科学实验的南芥、番茄等材料，主要用中国科学院搭载了用于空间生命科学实验的南芥、番茄等材料，主要用于空间微重力对高等植物基因表达影响的研究，实验研究结果将为今后于空间微重力对高等植物基因表达影响的研究，实验研
48、究结果将为今后载人航天事业的空间保障系统的建立提供科学依据。载人航天事业的空间保障系统的建立提供科学依据。中国林科院搭载了多种林草类种子，将用于国家中国林科院搭载了多种林草类种子，将用于国家“863”863”计划、国家自计划、国家自然科学基金等项目的研究工作，其研究成果对城市园林绿化的植物配置、然科学基金等项目的研究工作，其研究成果对城市园林绿化的植物配置、对恶劣生态环境的生物恢复等有着相当广泛的应用前景。对恶劣生态环境的生物恢复等有着相当广泛的应用前景。卫生部纳米生物技术重点实验室搭载了用于医学领域研制抗恶性肿瘤的卫生部纳米生物技术重点实验室搭载了用于医学领域研制抗恶性肿瘤的纳米药物生物原料
49、等多种重要植物品种，可望筛选出具有更高活性和合纳米药物生物原料等多种重要植物品种，可望筛选出具有更高活性和合成能力的抗恶性肿瘤的优良菌株，将产生相当大的经济效益。成能力的抗恶性肿瘤的优良菌株，将产生相当大的经济效益。另外，福建水产研究院、中国空间科学学会等单位搭载了水产动植物生另外，福建水产研究院、中国空间科学学会等单位搭载了水产动植物生命活体和中草药，进行水产生物太空诱变育种科学研究及水产生物航天命活体和中草药，进行水产生物太空诱变育种科学研究及水产生物航天搭载存活技术研究。搭载存活技术研究。65第65页，共127页，编辑于2022年，星期三二、诱变育种步骤出发菌株的选择出发菌株的选择处理菌
50、悬液的制备处理菌悬液的制备诱变处理诱变处理中间培养中间培养分离和筛选分离和筛选教材教材教材教材P38P3866第66页，共127页，编辑于2022年，星期三(一一)出发菌株的选择出发菌株的选择1自自然然界界新新分分离离的的野野生生型型菌菌株株，对对诱诱变变处处理理较较敏敏感感，容易达到好的效果。容易达到好的效果。2在在生生产产中中经经生生产产选选种种得得到到的的菌菌株株与与野野生生型型较较相相像像，也是良好的出发菌株。也是良好的出发菌株。3每每次次诱诱变变处处理理都都有有一一定定提提高高的的菌菌株株，往往往往多多次次诱诱变能积累较多的提高。变能积累较多的提高。4出出发发菌菌株株开开始始时时可可