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1、第二章 微生物菌种选育优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是显著改善和提高产品种类、产量以及质量的先决条件。菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状，使其符合工业生产的需要。本章主要内容第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源第二节 微生物发酵高产菌种选育第三节 菌种的退化和菌种保藏本章主要内容第一节第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源微生物发酵工业的菌种类型及来源第二节 微生物发酵高产菌种选育第三节 菌种的退化和菌种保藏来源：来源：自然界（如土壤、水和空气，以土壤最多）特点：特点：培养基原料廉价生长条件易于控制，生长迅速，产量高，酶活高是单产高的营养缺陷型突
2、变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最好还是抗噬菌体能力强的菌株菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素、毒素等），以保证安全发展趋势：发展趋势：野生菌诱发基因突变的变异菌基因重组的定向育种和代谢控制育种概述发酵工程菌类型：类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等1、细菌2、酵母菌3、霉菌4、放线菌5、担子菌6、藻类一、工业发酵常见的微生物种类1、细菌类2、酵母菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）酿酒酵母的应用：传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母片以及制造面包等，所以又称
3、为酿酒酵母近年来，提取核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。由于酵母菌体内的维生素、蛋白质含量较高，食用安全，所以啤酒酵母作为一种单细胞蛋白(SCP)可作食用、药用和饲料用酵母。它的转化酶可用于转化蔗糖，制造酒心巧克力。在维生素的微生物法测定中，啤酒酵母常被用于测定生物素、泛酸、硫胺素、肌醇等的含量。2、酵母菌假丝酵母（Candida）热带假丝酵母白色假丝酵母几种酵母的菌落形态用途：假丝酵母的蛋白质和维生素B含量都比啤酒酵母高。它能以尿素和硝酸盐作氮源，在培养基中不加其它因子即可生长。它能利用造纸工业中的亚硫酸废液，也能利用糖蜜、马铃薯淀粉和木材水解液等。因此能利用假丝酵母来处理工业和
4、农副产品加工业的废弃物，生产可食用的蛋白质，在综合利用中很有价值。此属中有的菌能转化50的糖成为甘油。假丝酵母也是脂肪酶的生产菌种，在工业上可用于绢纺原料的脱脂。2、酵母菌毕赤酵母属（Pichia）此菌分解糖的能力弱，不产生酒精。能氧化酒精，能耐高或较高浓度酒精。常使酒类和酱油产生白花，形成浮膜，为酿造工业中的有害菌，如粉状毕赤氏酵母。但其中的甲醇毕赤酵母却应用在基因工程菌中，用以表达基因工程蛋白。3、工业上常用的霉菌曲霉属（Aspergillus）曲霉的主要用途：食用色素生产糖化饲料有机酸、酶制剂是做酱、酿酒、制醋的主要菌种主要涉及种：米曲霉、酱油曲霉、黑曲霉酱豆3、工业上常用的霉菌青霉属（
5、Penicillium）青霉的主要用途：青霉素葡萄糖酸3、工业上常用的霉菌根霉属（Rhizopus）根霉的主要用途：米酒、黄酒淀粉糖化菌有机酸甾体转化主要涉及种：黑根霉、华根霉、米根霉3、工业上常用的霉菌毛霉属（Mucor）毛霉的主要用途：腐乳、酱油、豆豉，转化甾族化合物4、放线菌是一类G+菌、单细胞、丝状多核分支的、以孢子形式繁殖的、陆生性很强的原核微生物。显微镜下的放线菌放线菌菌落形态用于生产抗生素的放线菌5、担子菌（basidiomycetes）担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、橡胶物质和抗癌药物的研发。6、藻类（alga）藻类
6、中隶属原核微生物的蓝绿藻是最早的光合放氧生物，对地球表面从无氧的大气环境变为有氧环境起了巨大的作用。有不少蓝藻（如鱼腥藻）可以直接固定大气中的氮，以提高土壤肥力，使作物增产。还有的蓝藻为人们的食品，如著名的发菜和普通念珠藻（地木耳）、螺旋藻等。用藻类将CO2转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得石油，可占细胞干重的5%50%，合成的油与重油相同，加工后可转变成汽油、煤油和其他产品。左图：蓝宝石能源公司（Sapphire Energy）计划于2014年在美国-墨西哥边境以北靠近新墨西哥的哥伦布小镇建造一座300英亩的藻场，进行大规模示范并制造藻油（algae oils）。二、工业微生物的来源各菌
7、种保藏机构和大型发酵工厂的菌种保藏室工业微生物菌种从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中分离抗噬菌体的发酵菌株等。自然界如土壤、水、动植物体是微生物菌种的广泛来源。在特定的生境下可以分离到有特殊能力的微生物菌株三、菌种微生物的选择性分离菌株的分离和筛选分为以下几步：采 样富 集分 离 筛 选各种生境下的土壤是微生物菌种最全面的来源土样的采集方法采用平板划线法和稀释法，以时间为变量，进行纯种分离使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源pH7.07.5适于细菌和放线菌，pH4.5 6适于霉菌和酵母40利于放线菌孢子萌发，却不利
8、于细菌生长限制通入氧气使厌氧菌数量增加通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的类群比例减少人为控制条件使所期待的目的菌种占据优势采用涂布法和影印平板法，取分离的单菌落进行鉴定和小型发酵试验本章主要内容第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源第二节第二节 微生物发酵高产菌种选育微生物发酵高产菌种选育 自然选育 诱变育种 杂交育种 原生质体融合 基因工程育种第三节 菌种的退化和菌种保藏1、诱变育种定义：定义：诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标的突变株用于生产和研究。诱变育种除能提高产量外，还可达
9、到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺的目的，该方法简单、快速、收效显著仍被广泛采用。原理：原理：染色体畸变和基因突变两大类。诱变剂：诱变剂：能够提高生物突变频率，扩大变异幅度的物质。包括物理、化学诱变剂及生物诱变因子。物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、-射线、快中子。使用最方便且安全的是紫外线。化学诱变剂：碱基类似物、与碱基反应的物质。使用最多、最有效的是烷化剂。生物诱变剂：噬菌体、转座子。诱变程序：诱变程序：【诱变】出发菌株选择：野生型菌株；经历过生产条件考验的菌株处理菌悬液的制备：对数生长期、菌悬液的均一性、选择孢子或单倍体细胞 避免表型延迟现象诱变剂选择：诱变剂的致死量；诱变剂复合处
10、理【筛选】筛选方案的确定：初筛和复筛；营养缺陷突变株、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株、组成型突变株、抗性突变株等突变基因的表现：表型延迟现象（phenotypic lag）就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。往往是由于对数期细胞是多核或多倍体而造成的。隐性基因在杂合体上的出现以及菌体内原有酶系的存在是表型延迟的两大原因。克服表型延迟的方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌
11、落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。2、杂交育种定义：一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导和转化等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。程序：选择原始亲本诱导筛选直接亲本直接亲本之间亲和力鉴定杂交分离到基本培养基或选择性培养基筛选重组体重组体分析鉴定。微生物常规杂交方式微生物类别杂交方式供体与受体细胞关系 参与交换的遗传物质原核微生物接合体细胞间暂时沟通部分染色体杂合转化细胞不接触，吸收游离DNA片段个别或少数基因杂合转导细胞不接触，质粒、噬菌体介导个别或少数基因杂合真核微生物有性生
12、殖生殖细胞融合或接合整套染色体高频重组准性生殖体细胞接合整套染色体高频重组3、原生质体融合定义：定义：通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的工程，亦称为细胞融合。主要步骤：主要步骤：选择亲本原生质体的制备原生质体的融合原生质体的再生重组子筛选酶解法去壁（溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶）；菌龄；培养添加物；渗透压诱变使亲本带有遗传标记等量原生质体加聚乙二醇促进融合高渗条件下使细胞壁再生4、基因工程育种定义：基因工程是一种DNA体外重组技术，是在分子水平上对原有菌株的改造。基本过程：根据需要用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转入受体细胞,经过
13、复制、转录和翻译,表达出供体原有的遗传性状。通过基因工程改造的菌株称为工程菌株。应用基因工程手段来进行的育种方法又称为分子育种。DNA体外重组过程一般包括：1)目的基因即DNA片段的获得。2)与载体DNA分子的连接。3)重组DNA分子引入宿主细胞。4)阳性重组体的筛选与鉴定。5)外源基因的表达。本章主要内容第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源第二节 微生物发酵高产菌种选育第三节第三节 菌种的退化和菌种保藏菌种的退化和菌种保藏 菌种退化 菌种复壮 菌种保藏 一、菌种退化通常指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理状态和形态特征逐渐减退或消失的现象。（一）在生产中菌种退化的表现：（一）在生产
14、中菌种退化的表现：菌种的发酵力(如糖、氮的消耗)下降、繁殖力(如孢子的产生)下降、发酵产品的得率降低等。（二）菌种退化的原因（二）菌种退化的原因 1.菌种保藏不妥。2.连续传代，或经诱变得来的新菌株发生回复突变，发生基因突变。3.菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到某些不利条件，或是失去某些需要的条件。4.菌种混杂。在菌种继代培养过程中，不同品种间交叉感染，导致原有的性状丢失。（三）防止退化的措施（三）防止退化的措施 第一，合理育种，避免使用多核细胞，诱变后经培养及分离纯化再保存 第二，做好菌种的保藏工作，使菌种的优良特性得以保存。第三，应该满足其生长的要求。第四，尽量减少传代次数。第五，防止
15、菌种混杂，定期纯化菌种。二、菌种复壮狭义的菌种复壮：狭义的菌种复壮：指菌种发生衰退后，通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。广义的菌种复壮：广义的菌种复壮：是一种积极的措施。指的是菌种在生产性能尚未发生衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高。菌种复壮的方法：1.纯种分离。淘汰已衰退的个体。2.通过寄主体进行复壮。淘汰已衰退的个体。3.联合复壮。高剂量UV和低剂量的亚硝基胍（NTG）联合处理。三、菌种的保藏在生产发酵中，具有高产、有重要经济价值的某一代谢产物主生产能力的微生物菌种的保存和
16、长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。菌种保藏的基本原理：采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，使微生物处于代谢不活泼，生长受抑制的环境中。常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏、干燥载体保藏或冷冻干燥保藏、超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。一、蒸馏水悬浮法：最简单的保藏方法，将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10保藏，可用于好气性细菌和酵母等。二、传代保藏：将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。最好在基本培养基上传代，以低接种量来淘汰突变株，低温（5）来防止脱水降低代谢活力。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的
17、设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。可用于实验室中若干菌种的保藏，一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。此方法一般保存时间为36个月。三、矿物油浸没保藏 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保存，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。矿物油和液体石蜡都能作为保藏介质，用石蜡保藏时需预先试验看菌株对石蜡是否敏感或是否能利用石蜡为碳源进行生长。保藏时间为1 2年，2 3年应作一次存活试验。四、干燥载体保藏 将菌种接种于是当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸
18、皮等，以保藏菌种。此法适用于产芽孢或孢子的微生物保藏。一般细菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。五、冷冻保藏指将菌种于-20下的温度保藏，冷冻保藏为微生物菌种保藏非常有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时通常在培养基中加入一定的冷冻保护剂，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速度。冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。（一）普通冷冻保藏技术(-20)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。
19、或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。（二）超低温冷冻保藏技术(-60一-80)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10甘
20、油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。（三）液氮冷冻保藏技术 1、冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。2、液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1）待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积
21、20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。2）控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1/min，直到温度达-50；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液
22、相(-)96)或 气相(-156)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。3、复苏 1）从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2）迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以加速解；3）用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。六、真空冻干保藏 是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前常用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠
23、。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。七、寄主保藏 对不能进行人工培养的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等的保藏要借助其寄主。常见的有寄主传代培养保藏法、寄主液氨保藏法和冷冻干燥保藏法等。八、基因工程菌的保藏 基因工程菌株因携带外援DNA片段，外源质粒容易丢失，因此应该在保藏时提供具有生长选择压的环境进行保藏。比如抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。九、微生物活力和稳定性测定微生物活力和稳定性测定 所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限
24、和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。(一)种子质量的控制措施 菌种
25、稳定性的检测 无杂菌检测(二)种子质量标准 1、细胞或菌体：菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）；2、生化指标：种子液的糖、氮、磷的含量和pH值的变化 3、产物生产量：在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。4、酶活力：种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关系。本章掌握的重点1.掌握自然选育中微生物分离筛选的基本概念、原理及步骤。2.掌握自然选育、诱变育种、杂交育种及分子育种的概念和原理。3.掌握菌种衰退原因及防止衰退的措施。4.掌握菌种保藏目的、原理及方法。5.掌握几种常用的菌种宝藏方法，及各自优缺点。