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1、第二节基因工程的基本操作步骤第1页，共23页，编辑于2022年，星期三获得目的基因获得目的基因形成重组形成重组DNA分子分子将重组将重组DNA分子分子导入受体细胞导入受体细胞筛选含有目的基因筛选含有目的基因的受体细胞的受体细胞目的基因的表达目的基因的表达基基因因工工程程基基本本操操作作步步骤骤第2页，共23页，编辑于2022年，星期三一、获得目的基因一、获得目的基因1 1、目的基因较小且序列已知、目的基因较小且序列已知用化学方法直接用化学方法直接人工合成。人工合成。2 2、目的基因的全部或部分序列已知、目的基因的全部或部分序列已知用聚合酶用聚合酶链式反应（简称链式反应（简称PCRPCR）技术扩
2、增）技术扩增3 3、目的基因的序列是未知的、目的基因的序列是未知的从基因文库中获取目从基因文库中获取目的基因的基因第3页，共23页，编辑于2022年，星期三用某种限制酶切成多个片段用某种限制酶切成多个片段提取某种生物的提取某种生物的DNADNA第一步：建立基因文库（一般已做好）第一步：建立基因文库（一般已做好）将片段与载体连接起来将片段与载体连接起来导入受体菌（常用大肠杆菌）群体中导入受体菌（常用大肠杆菌）群体中基因文库基因文库第二步：从基因文库中获取目的基因第二步：从基因文库中获取目的基因根据目的基因的产物等特性，用原限制酶将目的基因切下。根据目的基因的产物等特性，用原限制酶将目的基因切下。
3、第4页，共23页，编辑于2022年，星期三用与切下目的基因的用与切下目的基因的同种同种限制酶切开载体限制酶切开载体DNA二、形成重组二、形成重组DNADNA分子分子用用DNA连接酶连接目的基因和载体连接酶连接目的基因和载体DNA，形成重组，形成重组DNA分子。（重组质粒分子。（重组质粒或重组病毒）或重组病毒）第5页，共23页，编辑于2022年，星期三三、将重组三、将重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞第6页，共23页，编辑于2022年，星期三构建重组质粒构建重组质粒第7页，共23页，编辑于2022年，星期三四、筛选含有目的基因的受体细胞四、筛选含有目的基因的受体细胞在含有四环在含有
4、四环素的选择培素的选择培养基上培养养基上培养目的基因目的基因抗四环抗四环素基因素基因导导入入只有含重组只有含重组DNA分分子的细胞能生长子的细胞能生长抗四环抗四环素基因素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因与目的基因两侧与目的基因两侧相同的酶切位点相同的酶切位点含目的基因含目的基因第8页，共23页，编辑于2022年，星期三含四环素的培养基含四环素的培养基含氨苄青霉素的培养基含氨苄青霉素的培养基含目的基因含目的基因第9页，共23页，编辑于2022年，星期三五、目的基因的表达五、目的基因的表达 受体细胞是原核细胞时，目的基因可留在质粒上；受体细胞是原核细胞时，目的基因可留在质粒上；受体细胞是真核细
5、胞时，目的基因必须插入染色体受体细胞是真核细胞时，目的基因必须插入染色体DNADNA。第10页，共23页，编辑于2022年，星期三检测目的基因是否插入了受体细胞染色体检测目的基因是否插入了受体细胞染色体DNADNA中中DNADNA分子杂交技术分子杂交技术将将DNADNA固定在膜上，加热解旋固定在膜上，加热解旋将带有放射性同位素标记的含目的基因的将带有放射性同位素标记的含目的基因的DNADNA片段片段（探针，一般为单链探针，一般为单链）加到膜上）加到膜上提取受体细胞基因组提取受体细胞基因组DNADNA一段时间后冲洗一段时间后冲洗检测膜上是否有杂交带（放射性）检测膜上是否有杂交带（放射性）第11页
6、，共23页，编辑于2022年，星期三第12页，共23页，编辑于2022年，星期三检测目的基因是否转录检测目的基因是否转录分子杂交技术分子杂交技术固定在膜上的变成固定在膜上的变成mRNAmRNA，探针与，探针与相同相同检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗原-抗体杂交抗体杂交检测生物个体是否出现相应性状检测生物个体是否出现相应性状第13页，共23页，编辑于2022年，星期三活动：完成活动：完成“基因工程操作程序的模拟操作基因工程操作程序的模拟操作”思考：思考：基因工程的理论基础是什么？基因工程的理论基础是什么？第14页，共23页，编辑于2022年，星期三原核生物界原核生物
7、界原生生物界原生生物界植物界植物界动物界动物界真菌界真菌界第15页，共23页，编辑于2022年，星期三DNA的结构和功能的结构和功能第16页，共23页，编辑于2022年，星期三转录转录翻译翻译遗传信息的遗传信息的表达机制相表达机制相同同第17页，共23页，编辑于2022年，星期三整个生物界共用一套密码子整个生物界共用一套密码子第18页，共23页，编辑于2022年，星期三二、基因工程的理论基础DNA的结构相同（双螺旋结构）的结构相同（双螺旋结构）DNA功能相同（即复制方式和表达功能相同（即复制方式和表达机制相同）机制相同）整个生物界共用一套密码子整个生物界共用一套密码子哪些技术能保证基因工程能够
8、实施？哪些技术能保证基因工程能够实施？第19页，共23页，编辑于2022年，星期三获得目的基因获得目的基因形成重组形成重组DNA分子分子将重组将重组DNA分子分子导入受体细胞导入受体细胞筛选含有目的基因筛选含有目的基因的受体细胞的受体细胞目的基因的表达目的基因的表达工具工具?限制酶限制酶DNA连接酶连接酶载体载体:质粒、病质粒、病毒毒第20页，共23页，编辑于2022年，星期三（3）蛋白组分析）蛋白组分析蛋白质合成后，还要进行磷酸化、糖基化、除蛋白质合成后，还要进行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白质剪切等翻译后修饰，仅去末端氨基酸、蛋白质剪切等翻译后修饰，仅从核酸的序列并不能完全描述一个蛋
9、白质。尽从核酸的序列并不能完全描述一个蛋白质。尽管分析不同细胞类型中表达的蛋白已近管分析不同细胞类型中表达的蛋白已近20年，年，直到直到1995年才由年才由Wilkins和和Williams提出一个提出一个与基因组相对应的名词蛋白组分析的核心技术与基因组相对应的名词蛋白组分析的核心技术是蛋白质双向电泳。是蛋白质双向电泳。技术上三大发明：技术上三大发明：（1）基因转移载体的发现基因转移载体的发现1967，T.F.Roth&D.R.Helinski，发现质粒的自我复制能力，并能够在细菌之间转移。基因是基因是可以转移的。可以转移的。（2）工具酶的发明工具酶的发明1972 H.C.Smith、W.Ar
10、ber&D.Nathans从流感嗜血杆菌中分离得到限制性内切酶；1970年，逆转录酶的发现使真核细胞的 基因制备成为可能；此后，多种限制酶和连接酶发现。基因是可切割的。基因是可切割的。（3）DNA体外重组的实现体外重组的实现1972年，美 Berg 第一次构建出了体外重组DNA分子。重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功1973，H.Boyer&S.Cohen选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。重组的DNA转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA。基因工程诞生元年基因工程诞生元年第21页，共23页，编辑于2022年，星期三技
11、术进一步推动基因工程的发展：技术进一步推动基因工程的发展：（1）第一例转基因动物和转基因植物问世第一例转基因动物和转基因植物问世1980 科学家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。1983，科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。（2）PCR技术的发明技术的发明1988年，美 K.Mullis发明PCR技术，使基因工程进一步发展。The Nobel Prize in Chemistry 1993for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)methodKary B.Mullis La Jolla,CA,USA 第
12、22页，共23页，编辑于2022年，星期三为了将上图的目的基因与左图为了将上图的目的基因与左图的质粒结合，应该用的质粒结合，应该用_限制酶切开质粒，这是为了保限制酶切开质粒，这是为了保证目的基因两端与质粒露出的证目的基因两端与质粒露出的_能够碱基互补配对，能够碱基互补配对，之后在之后在_作用下才能够牢固结合，形成作用下才能够牢固结合，形成一个一个_。将重组质粒导。将重组质粒导入受体细胞后，受体细胞将获得入受体细胞后，受体细胞将获得_能力能力。EcoR.1切点Hand.3切点Taq.1切点抗四环素基因EcoR.1EcoR.1重组质粒CCGAATTCGTAGGCTTAAGCATACTGAATTCTCATGACTTAAGAGT目的基因目的基因用用EcoR.1EcoR.1切割下来的目的基因切割下来的目的基因思考题黏性末端黏性末端DNADNA连接连接酶酶抗四环素抗四环素第23页，共23页，编辑于2022年，星期三