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1、第二节基因工程的原理和技术正式第1页，共44页，编辑于2022年，星期二要想将某个特定基因与质粒相连，要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性核酸内切酶？需要用几种限制性核酸内切酶？思考题：思考题：第2页，共44页，编辑于2022年，星期二T G C AA C G TA C GTG C AT第3页，共44页，编辑于2022年，星期二A C GA C GT TG C AG C AGG标记基因标记基因A C GA C GT TG C AG C AT T外源基因外源基因A C GA C GT TG C AG C AT T重组质粒或重组重组质粒或重组DNA第4页，共44页，编辑于2022年，星期
2、二传统的生产胰岛素的方法只能从猪和羊的胰传统的生产胰岛素的方法只能从猪和羊的胰腺中提取腺中提取,获得获得1g胰岛素大约需要胰岛素大约需要100Kg的的猪胰脏猪胰脏糖尿病治疗糖尿病治疗1978年年,科学家在大肠杆菌中成功表达了人胰岛素科学家在大肠杆菌中成功表达了人胰岛素,并于并于1982年被美国批准上市年被美国批准上市基因工程的基本原理基因工程的基本原理 让人们让人们感兴趣的基因感兴趣的基因（目的基因）在宿主（目的基因）在宿主细胞中细胞中稳定稳定和和高效高效表达。表达。第5页，共44页，编辑于2022年，星期二第6页，共44页，编辑于2022年，星期二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序
3、1 1、获得目的基因、获得目的基因2 2、形成重组、形成重组DNADNA分子分子3 3、将重组、将重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞5 5、目的基因的表达、目的基因的表达剪切剪切拼接拼接导入导入筛选筛选表达表达第7页，共44页，编辑于2022年，星期二目前被较广泛提取目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等。基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤一、
4、提取目的基因一、提取目的基因将需要的基因从供体生物将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。的细胞内提取出来。供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶第8页，共44页，编辑于2022年，星期二目的基因的序列未知目的基因的序列未知1、从基因文库中获取、从基因文库中获取目的基因的序列已知目的基因的序列已知2、利用聚合酶链式反应、利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增技术扩增3、人工合成、人工合成获取目的基因的常用方法：获取目的基因的常用方法：第9页，共44页，编辑于2022年，星期二1、基因文库的构建基因文库的构建直接分离法（或鸟
5、枪法）直接分离法（或鸟枪法）该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。第10页，共44页，编辑于2022年，星期二2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸
6、合成技术。可以获得大量的目的基因。片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。PCR扩增仪扩增仪第11页，共44页，编辑于2022年，星期二氢键断裂，形成单链氢键断裂，形成单链DNADNA。引物与引物与DNADNA模板结合，模板结合，形成局部双链。形成局部双链。在酶的作用下，不断延伸，在酶的作用下，不断延伸，合成双链合成双链DNADNA。多次循环，获得大量多次循环，获得大量双链双链DNADNA分子。分子。uP PC CR R技技术术扩扩增增第12页，共44页，编辑于2022年，星期二目的基目的基因的因的mRNAmRNA逆转录逆转录单链单链DNADNA合成合成双链双链DNADNA（目的基因）（目
7、的基因）蛋白质蛋白质氨基酸氨基酸序列序列推测推测mRNAmRNA的的核苷酸核苷酸序列序列推测推测结构基因结构基因的核苷酸的核苷酸序列序列化学化学合成合成目目的的基基因因人工合成法人工合成法逆转录法逆转录法根据已知氨基酸序列直接合成根据已知氨基酸序列直接合成DNA第13页，共44页，编辑于2022年，星期二二、二、形成重组形成重组DNA分子分子 核心核心质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端第14页，共44页，编辑于20
8、22年，星期二目的基因与质粒的连接第15页，共44页，编辑于2022年，星期二三、将重组三、将重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞（1 1）常用的受体细胞：）常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。探究：转基因过程中，怎样选择受体细胞？探究：转基因过程中，怎样选择受体细胞？转基因植物转基因植物 转基因动物转基因动物 转基因微生物转基因微生物植物体细胞或受精卵植物体细胞或受精卵受精卵受精卵大肠杆菌、枯草杆菌、酵母大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等菌等第16页，共44页，编辑于2022年，星期二探究：为什
9、么常用微生物作为受体细胞？探究：为什么常用微生物作为受体细胞？目的基因导入受体细胞后，就可以随目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌繁殖的着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能够获得大速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。量的目的基因。微生物可通过微生物可通过发酵发酵大量繁殖。大量繁殖。第17页，共44页，编辑于2022年，星期二（2 2）将目的基因导入微生物细胞）将目的基因导入微生物细胞受体细胞：受体细胞：细菌细菌氯化钙氯化钙 细胞壁的通透性增大细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的
10、繁殖而复制目的基因随受体细胞的繁殖而复制第18页，共44页，编辑于2022年，星期二将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法第19页，共44页，编辑于2022年，星期二 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。方法。第20页，共44页，编辑于2022年，星期二第21页，共44页，编辑于2022年，星期二将目的基因导
11、入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术提纯基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植第22页，共44页，编辑于2022年，星期二1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术（最多、最有效）（最多、最有效）3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理，处理，以增加细菌细胞壁的通透性。以增加细菌细胞壁的通透性。第23页，共44页，编辑于2022年，星期二探究：如何把导入了目的基因的受体细胞
12、筛选出探究：如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？来？1）原理：）原理：2）方法：）方法：3）举例）举例所有受所有受体细胞体细胞接种接种含有四环素含有四环素的培养基的培养基筛选筛选生活的受生活的受体细胞体细胞导入导入重组重组DNADNA分子分子（抗四环素基因）（抗四环素基因）培养培养含重组含重组DNADNA分子分子的受体细胞的受体细胞四、筛选有目的基因的受体细胞四、筛选有目的基因的受体细胞质粒上有抗生素的抗性基因质粒上有抗生素的抗性基因利用选择培养基筛选利用选择培养基筛选第24页，共44页，编辑于2022年，星期二筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞前三步的处理十分繁锁，为保
13、证目的基因得到有效利用，前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。测出来。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的
14、进一步培养、研究。留有表达产物的进一步培养、研究。第25页，共44页，编辑于2022年，星期二多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入说明未
15、摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。虫基因并得到表达。第26页，共44页，编辑于2022年，星期二受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因一分子后就说明目的基因一定能完成表达吗？定能完成表达吗？含有目的基因的受体细胞不一定都能表达。含有目的基因的受体细胞不一定都能表达。(五五五五)目的基因的表达目的基因的表达目的基因的表达目的基因的表达看到目的性状或分离到目的基因看到目的性状或分离到目的基因看到目的性状或分离到目的基因看到目的性状或分离到目的基因表达产物表达产物表达产物表达产物 外源基因在
16、受体细胞内表达的理论基础外源基因在受体细胞内表达的理论基础基因是控制生物性状的基本单位基因是控制生物性状的基本单位生物界共用一套遗传密码生物界共用一套遗传密码遗传信息的传递都遵循中心法则的信息流动方遗传信息的传递都遵循中心法则的信息流动方向向第27页，共44页，编辑于2022年，星期二人胰岛素原基因在大肠杆菌中只能表达和人人胰岛素原基因在大肠杆菌中只能表达和人胰岛素原胰岛素原，要经进一步的加工后才能获得，要经进一步的加工后才能获得具生物活性具生物活性的胰岛素。的胰岛素。第28页，共44页，编辑于2022年，星期二甲生物甲生物乙生物乙生物取出优取出优秀基因秀基因“剪切剪切”“拼接拼接”新类型新类
17、型表达表达新的生物产品新的生物产品基基因因敲敲除除技技术术转转基基因因技技术术生物生物新类型新类型敲敲除除不不利利基基因因新的生物产品新的生物产品第29页，共44页，编辑于2022年，星期二能力提升：能力提升：人的糖蛋白必须经过内质网和人的糖蛋白必须经过内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是（体细胞是（）A A 大肠杆菌大肠杆菌 B B 酵母菌酵母菌 C T4C T4噬菌体噬菌体 D D 质粒质粒DNADNAB B第30页，共44页，编辑于2022年，星期二知识延伸知识延伸
18、DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，解开，把单股的把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的所要查明的DNA或基因。或基因。第31页，共44页，编辑于2022年，星期二基因探针（基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交带探针）与目的基因杂交，有无杂交带第32页，共44页，编辑于2022年，星期二基因工程的基本操作程
19、序目的基因的获取目的基因的获取形成重组形成重组DNA分子；分子；将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因表达筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因表达1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、抗原分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定四、本节小结：第33页，共44页，编辑于2022
20、年，星期二例如：例如：将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。步培养、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物第34页，共44页，编辑于2022年，星期二1 1、用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下、用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是列叙述不正确的是 A A常用相同的限制性内切酶处理的基因和质粒常用相同的限制性内切酶处理的基
21、因和质粒 B BDNADNA连接酶和连接酶和RNARNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶 C C可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒重组质粒 D D导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达 B巩固练习巩固练习第35页，共44页，编辑于2022年，星期二2下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是()利用利用mRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCR技术技术 利用利用DNA转录转录
22、 人工合成人工合成A B CDD第36页，共44页，编辑于2022年，星期二3基因工程又叫基因拼接技术。基因工程又叫基因拼接技术。(1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的目的基因转录的 为模板，为模板，成互补的单链成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成，然后在酶的作用下合成 。(2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、。(3)假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与
23、目的基因酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有连接酶。连接产物至少有 种种环状环状DNA分子，它们分别分子，它们分别 是是 。信使信使RNA 逆转录逆转录 双链双链DNA(目的基因目的基因)动植物细胞动植物细胞 3 运载体自连的、目的基因片段自连的、运载体自连的、目的基因片段自连的、运载体与目的基因片段相连的环状运载体与目的基因片段相连的环状DNA分子分子 第37页，共44页，编辑于2022年，星期二4如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能力如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能力提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的
24、过程中，提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在生态安全方面可能会出现什么问题？（列举两在生态安全方面可能会出现什么问题？（列举两点）点）将目的基因插人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体，通过农将目的基因插人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体，通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转化的香蕉细胞通过杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转化的香蕉细胞通过组织培养形成植株。组织培养形成植株。生态安全问题包括：生态安全问题包括：外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；转基因植株扩散对生物多
25、样性的影响；转基因植株扩散对生物多样性的影响；转基因植物残体或分泌物对环境的影响。转基因植物残体或分泌物对环境的影响。第38页，共44页，编辑于2022年，星期二剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达（一）获得目的基因（一）获得目的基因（二）形成重组（二）形成重组DNA分子分子（三）将重组（三）将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞(四四)筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞(五五)目的基因的表达目的基因的表达 四、基因工程的基本操作步骤四、基因工程的基本操作步骤第39页，共44页，编辑于2022年，星期二步骤一步骤一 获得目的基因获得目的基因人工合成人工合成u利用利用PCRP
26、CR技术扩增技术扩增已知序列：已知序列：从基因文库获得从基因文库获得未知序列：未知序列：(DNA library)(DNA library)聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)(Polymerase Chain Reaction)化化学学合合成成第40页，共44页，编辑于2022年，星期二鸟枪法鸟枪法供体供体细胞细胞DNADNA限限制制酶酶许多许多DNADNA片段片段载入载入运运载载体体导入导入受体受体细胞细胞扩增扩增产生产生特定特定性状性状分分离离目目的的基基因因从基因文库获得从基因文库获得第41页，共44页，编辑于2022年，星期二PCR技术技
27、术原理：原理：前提：前提：条件条件方式方式DNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增，即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）指数指数2 2n n模板模板DNA、两个、两个DNA引物、四种脱氧核引物、四种脱氧核苷酸、热稳定苷酸、热稳定DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）第42页，共44页，编辑于2022年，星期二n 过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性变性退火退火延伸延伸第43页，共44页，编辑于2022年，星期二目的基因的检测与表达目的基因的检测与表达检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定第44页，共44页，编辑于2022年，星期二