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1、基因工程第二章基因工程的基本操作程序第一页，讲稿共六十六页哦一一.目的基因目的基因(Target DNA)(Target DNA)制备制备 制备制备制备制备DNADNADNADNA片段可通过片段可通过片段可通过片段可通过5 5 5 5个途径个途径个途径个途径：1 1 1 1、从生物基因组群体中分离目的基因、从生物基因组群体中分离目的基因、从生物基因组群体中分离目的基因、从生物基因组群体中分离目的基因 2 2 2 2、人工合成、人工合成、人工合成、人工合成 3 3 3 3、PCRPCRPCRPCR反应合成反应合成反应合成反应合成DNA DNA DNA DNA 4 4 4 4、mRNAmRNAmR
2、NAmRNA差异显示法获得目的基因差异显示法获得目的基因差异显示法获得目的基因差异显示法获得目的基因 5 5 5 5、机械的方法如超声波把基因组打成片段、机械的方法如超声波把基因组打成片段、机械的方法如超声波把基因组打成片段、机械的方法如超声波把基因组打成片段目的基因是目的基因是目的基因是目的基因是指准备导入受体细胞的，以研究或应用指准备导入受体细胞的，以研究或应用指准备导入受体细胞的，以研究或应用指准备导入受体细胞的，以研究或应用为目的所需要的为目的所需要的为目的所需要的为目的所需要的外源基因外源基因外源基因外源基因。片段来源：片段来源：片段来源：片段来源：原核生物和真核生物原核生物和真核生
3、物原核生物和真核生物原核生物和真核生物第二页，讲稿共六十六页哦1 1、从生物基因组群体中分离目的基因从生物基因组群体中分离目的基因 主要有以下主要有以下几种方法：几种方法：限制性内切酶法（鸟枪法）限制性内切酶法（鸟枪法）mRNA或或cDNA钓取法（反转录法）钓取法（反转录法）第三页，讲稿共六十六页哦A鸟枪法鸟枪法（霰弹法）（霰弹法）美国塞莱拉遗传公司创始人雷格美国塞莱拉遗传公司创始人雷格美国塞莱拉遗传公司创始人雷格美国塞莱拉遗传公司创始人雷格 文特发明的，是文特发明的，是文特发明的，是文特发明的，是20202020世纪最伟大的生物技世纪最伟大的生物技世纪最伟大的生物技世纪最伟大的生物技术发明之
4、一。术发明之一。术发明之一。术发明之一。鸟枪法是将基因组打成小片段进行测序，然后再利用计算机对这些片段鸟枪法是将基因组打成小片段进行测序，然后再利用计算机对这些片段鸟枪法是将基因组打成小片段进行测序，然后再利用计算机对这些片段鸟枪法是将基因组打成小片段进行测序，然后再利用计算机对这些片段进行排序和组装，重新组装成一个完整的基因组。进行排序和组装，重新组装成一个完整的基因组。进行排序和组装，重新组装成一个完整的基因组。进行排序和组装，重新组装成一个完整的基因组。鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操
5、作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性第四页，讲稿共六十六页哦 鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNA片段，然后通过快速有效的筛片段，然后通过快速有效的筛片段，然后通过快速有效的筛片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的选程序从众多克隆中分离出含有目的选程序从众多克隆中分离出含有目的选
6、程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基基因的目的重组子，进而获得目的基基因的目的重组子，进而获得目的基基因的目的重组子，进而获得目的基因。因。因。因。鸟枪法适用于原核鸟枪法适用于原核鸟枪法适用于原核鸟枪法适用于原核细菌目的基因的细菌目的基因的细菌目的基因的细菌目的基因的克隆分离克隆分离克隆分离克隆分离 第五页，讲稿共六十六页哦染色体的切断染色体的切断染色体的切断染色体的切断与载体连接与载体连接转化受体细胞转化受体细胞筛选含目的基因的重组子筛选含目的基因的重组子筛选含目的基因的重组子筛选含目的基因的重组子鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目
7、的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略第六页，讲稿共六十六页哦1、染色体、染色体DNA的切断的切断超声波处理：超声波处理：超声波处理：超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端片段长度均一，大小可控，平头末端片段长度均一，大小可控，平头末端片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：全酶切：全酶切：全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接片段长度不均一，粘性末端便于连接片段长度不均一，粘性末端便于连接片段长度不均一，粘性末端便于连接,但有可但有可但有可但有可 能使目的基因断开，大小不可控能使目的基因断开，大小不可控能使目的基因断开，大小不可控能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：部分酶切：
8、部分酶切：部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，片段长度可控，含有粘性末端，片段长度可控，含有粘性末端，片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整目的基因完整目的基因完整目的基因完整第七页，讲稿共六十六页哦与载体连接与载体连接与载体连接与载体连接 如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择则选择则选择则选择多拷贝克隆载体多拷贝克隆载体多拷贝克隆载体多拷贝克隆载体；如果采用基因产物功能检测法筛选，则如果采用基因产物功能检测法筛选，则如果采用基因产物功能
9、检测法筛选，则如果采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达选择表达选择表达选择表达型载体型载体型载体型载体第八页，讲稿共六十六页哦如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择择择择大肠杆菌作为受体细胞大肠杆菌作为受体细胞大肠杆菌作为受体细胞大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，
10、则选择能使目的基选择能使目的基选择能使目的基选择能使目的基因表达的受体细胞因表达的受体细胞因表达的受体细胞因表达的受体细胞转化受体细胞转化受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）第九页，讲稿共六十六页哦鸟枪法操作的改进（一）鸟枪法操作的改进（一）鸟枪法操作的改进（一）鸟枪法操作的改进（一）使用这一改进方法的使用这一改进方法的使用这一改进方法的使用这一改进方法的前提条
11、件前提条件前提条件前提条件是：目的基因的酶切图是：目的基因的酶切图是：目的基因的酶切图是：目的基因的酶切图谱已知。谱已知。谱已知。谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNADNADNADNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率整性，从而提高重组子中目的重组子的出
12、现频率整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNA第十页，讲稿共六十六页哦鸟枪法操作的改进（二）鸟枪法操作的改进（二）鸟枪法操作的改进（二）鸟枪法操作的改进（二）例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb1.8 kb的的的的SalISalISalI片段中，将染色体片段中，将染色体片段中，将染色体片段中，
13、将染色体片段中，将染色体片段中，将染色体DNADNADNA用用用用用用SalISalISalI切切切切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于片切下相当于片切下相当于片切下相当于1.6-2.0 kb1.6-2.0 kb大小区域大小区域大小区域大小区域大小区域大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收内的凝胶块，从此凝胶块中回收内的凝胶块，从此凝胶块中回收内的凝胶块，从此凝胶块中回收内的凝胶块，从此凝胶块中回收内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNADNADNA片段，然后与载体进行拼接片段，然后与载体进行拼接片段，然后与载体
14、进行拼接片段，然后与载体进行拼接片段，然后与载体进行拼接片段，然后与载体进行拼接2.0kb1.6kb1.8kb在连接前将在连接前将DNA片段进行分级分离片段进行分级分离第十一页，讲稿共六十六页哦鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进凝胶凝胶DNA片段回收技术片段回收技术冻融法冻融法冻融法冻融法滤纸法滤纸法滤纸法滤纸法吸附法吸附法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法溶解法溶解法第十二页，讲稿共六十六页哦鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的
15、背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构第十三页，讲稿共六十六页哦BcDNA法法cDNAcDNA法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法 cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基
16、因的基本程序法分离目的基因的基本程序cDNAcDNA法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的mRNAmRNA的多聚核的多聚核糖体提取出来，分离出糖体提取出来，分离出mRNAmRNA，然后以，然后以mRNAmRNA为模板，用反转录酶合成一为模板，用反转录酶合成一个互补的个互补的DNADNA，即，即cDNAcDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链成为双链DNADNA分子。分子。第十四页，讲稿共六十
17、六页哦提取细胞总提取细胞总mRNA，合成总合成总cDNA第十五页，讲稿共六十六页哦cDNAcDNA法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法mDNAmDNA（1 1 1 1）c c c cDNADNA第一链的合成第一链的合成第一链的合成第一链的合成 5ppp55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH335ppp55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp555ppp55ppp5G G AAAAAA
18、AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55cDNAcDNA第一链第一链第一链第一链引物引物引物引物退火退火退火退火逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPs第十六页，讲稿共六十六页哦（2 2）c cDNA第二链的合成第二链的合成自身引导法自身引导法置换合成法置换合成法引导合成法引导合成法第十七页，讲稿共六十六页哦c c c cDNADNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成煮沸煮沸煮沸煮沸NaOHNaOHAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA5ppp55ppp5GGAAAA
19、AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1自身引导法：获得的双链自身引导法：获得的双链自身引导法：获得的双链自身引导法：获得的双链cDNA5cDNA5端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失端会有
20、几对碱基缺失端会有几对碱基缺失第十八页，讲稿共六十六页哦c c c cDNADNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成 DNApol dNTPsDNApol dNTPsRNaesHRNaesH5ppp55ppp5GGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApp 5555S1S1 AAAA AAAATTTTTTOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
21、TTTTTTTOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3333T4-DNA ligaseT4-DNA ligase置换合成法：获得的双链置换合成法：获得的双链置换合成法：获得的双链置换合成法：获得的双链cDNA5cDNA5端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失第十九页，讲稿共六十六页哦c c c cDNADNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成 dCTPdCTPTdTTdT5ppp5ppp55GGAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTT
22、TTTTpp 5533 HOHO5ppp55ppp5G G AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCOHOH 3333 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGG33 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAOHOH 33NaOHNaOH退火退火退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPs引导
23、合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链cDNAcDNA能保留完整的能保留完整的能保留完整的能保留完整的55端序列端序列端序列端序列第二十页，讲稿共六十六页哦cDNAcDNA法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法法克隆目的基因的基本方法双链双链双链双链双链双链c c c c c cDNADNADNA的克隆的克隆的克隆的克隆的克隆的克隆 双链平头的双链平头的双链平头的双链平头的双链平头的双链平头的cDNAcDNAcDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法
24、克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是ATATAT同聚物尾，这样
25、重组分子同聚物尾，这样重组分子同聚物尾，这样重组分子同聚物尾，这样重组分子同聚物尾，这样重组分子同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和可通过加热局部变性和可通过加热局部变性和可通过加热局部变性和可通过加热局部变性和可通过加热局部变性和S1S1S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶
26、切口，以便插入片段回收 第二十一页，讲稿共六十六页哦cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序完备分离程序完备分离程序完备分离程序完备分离程序 提提取取细细胞胞总总mRNA，合合成成总总cDNA，将将之之全全部部克克隆隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛筛选选时时，若若使使用用的的是是多多拷拷贝贝载载体体，则则采采用用菌菌落落原原位位杂杂交交法法筛筛选选；若若使使用用的的是是表表达达型型载载体体，则则采采用用菌菌落落免疫杂交法筛选免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于完备分离程序适
27、用于mRNA分子数少的目的基因的分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等基因等 第二十二页，讲稿共六十六页哦cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序特异分离程序特异分离程序特异分离程序特异分离程序 提提取取细细胞胞总总mRNA，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离，回回收收目目标标mRNA，由由此此合合成成双双链链cDNA，然然后后进进行行克克隆隆 特特异异分分离离程程序序较较适适用用于于mRNA丰丰度度极极高高的的目目的的基因克隆如血红蛋白基因
28、等基因克隆如血红蛋白基因等 第二十三页，讲稿共六十六页哦cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序差异分离程序差异分离程序差异分离程序差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克，因而这种程序较适用于分离克隆新基因隆新基因 例如：正常的大鼠例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆
29、这些新基因，进而研究其转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能生物学功能 第二十四页，讲稿共六十六页哦差异分离程序差异分离程序差异分离程序差异分离程序 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3FR3T3细胞细胞细胞细胞正常的正常的正常的正常的FR3T3FR3T3细胞细胞细胞细胞总总总总mRNAmRNA总总总总mRNAmRNAcDNAcDNA双链双链双链双链cDNAcDNA单链单链单链单链cDNAcDNA提取提取提取提取mRNAmRNA合成合成合成合成cDNAcDNA合成第二链合成第二链合成第二链合成第二链克隆克隆克隆克隆提取提取提取提取mRNAmRNA共
30、价交联共价交联共价交联共价交联上柱上柱上柱上柱原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交病毒诱导表达的基病毒诱导表达的基病毒诱导表达的基病毒诱导表达的基因因因因cDNAcDNA克隆克隆克隆克隆第二十五页，讲稿共六十六页哦cDNAcDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的mRNA分子都具有分子都具有polyA结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNA半衰期很短半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 第二十六
31、页，讲稿共六十六页哦CPCR法法 PCR(Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶）法，又称为聚合酶链反应或链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序聚合程序使用使用PCR法克隆目的基因的法克隆目的基因的前提条件前提条件是：是：已知待扩增目的基因或已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物合反应必需的双引物PCRPCR法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理第二十七页，讲稿共六
32、十六页哦5555目的基因目的基因目的基因目的基因55变性变性变性变性加热加热加热加热5555引物引物引物引物退火退火退火退火5555底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合55555555加热加热加热加热变性变性变性变性55555555555555555555555555555555555555555555555555退火退火退火退火 引物引物引物引物底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合加热加热加热加热变性变性变性变性引物引物引物引物退火退火退火退火底物底物底物底物聚合聚合聚合聚合1 12 23 3第二十八页，讲稿共六十六页哦 由由Taq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中，其
33、产物中，其3 3末端总是会带有一末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A A，因为，因为Taq Taq DNADNA聚合酶对聚合酶对dATPdATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取时即可以采取TdTTdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的的T T载体克隆载体克隆 PCRPCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序5555AAAATTTT5555PCRPC
34、R扩增产物扩增产物扩增产物扩增产物T T 载体载体载体载体T7T7lacZlacZMCSMCSorioriApAprr第二十九页，讲稿共六十六页哦D化学合成法化学合成法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成的单元操作化学合成的单元操作DNA化学合成的用途化学合成的用途第三十页，讲稿共六十六页哦化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法全基因合成全基因合成全基因合成全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序序列已知，有三种战略：列已知，有三种战略：（1 1）小片段粘接法：）小片段粘接法：根据目根据目的基因
35、全序列，分别合成的基因全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段小片段混合退火混合退火混合退火混合退火T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体 第三十一页，讲稿共六十六页哦化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法全基因合成全基因合成全基因合成全基因合成混合退火混合退火混合退火混合退火（2）补钉延长法：）补钉延长法：根据目的基因根据目的基因两条互补链两条互补链全序列，分别合成全序列，分别合成12-15碱基长的单链碱基长的单链DNA小片
36、段以及小片段以及20-30碱基长的单链碱基长的单链DNA中片段中片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合第三十二页，讲稿共六十六页哦化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法全基因合成全基因合成全基因合成全基因合成（3 3）大片段酶促法：）大片段酶促法：）大片段酶促法：）大片段酶促法：混合退火混合退火混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因根据目的基因根据目的基因的的的的全序列，分别合成全序列，分别合成全序列，分别合
37、成全序列，分别合成40-5040-50碱基长的单链碱基长的单链碱基长的单链碱基长的单链DNADNA片段片段片段片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合第三十三页，讲稿共六十六页哦化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法全基因合成全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的的单片段愈短，收率单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合就愈高，但由于化
38、学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合则合成成50个碱基长的个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有7.7%第三十四页，讲稿共六十六页哦生物体对简并密码子的生物体对简并密码子的偏爱性偏爱性，合成系列探针，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间个核苷酸之间探针内部不应出现可能的探针内部不应
39、出现可能的互补区域互补区域化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编编码的码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到法得到的重组子，最终获得含有目的基因的的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子。目的重组子。由于大
40、多数氨基酸拥有由于大多数氨基酸拥有简并密码子简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问故在探针序列的设计时必须考虑下列问题题:第三十五页，讲稿共六十六页哦化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法化学合成法的基本方法探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleCys Met Asp Glu Met Lys Ar
41、g Asn Ile所有可能的所有可能的所有可能的所有可能的所有可能的所有可能的DNADNADNA序列序列序列序列序列序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATATGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATATGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C T GATG G G T T C T GATG G G T T C C C CGA CGA CGA CGG CGG CGG CGT CGT CGT CGC CGC CGC设计的简并探针序列设计的简并探针序列设计的简并探针序列设计的简并探针序列设计的简并探针序列设计的简并探针序列
42、TGTATGGACGAIATGATGTATGGACGAIATGATGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGTATGGATGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGATGCATGGATGAIATGATGCATGGATGAIATGA A A A G G G此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的ESTESTEST数据库进行倾向性简
43、并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计expressed sequence tagexpressed sequence tagexpressed sequence tag第三十六页，讲稿共六十六页哦化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作 化化学学合合成成DNA的的实实质质是是按按照照序序列列要要求求将将脱脱氧氧核核苷苷酸酸单单体体一一个个个个接接上上去去，每每接接一一个个单单体体就就是是一一个个循循环环反反应应，包包括括：基基团团保保护护、分分离离、
44、缩合、分离、去保护缩合、分离、去保护五大操作单元。五大操作单元。从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，DNA化学合成有化学合成有磷酸二酯法、磷酸三磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有具体操作过程又有液相合成和固相合液相合成和固相合成成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，分离程序简便，DNA合成仪就是根据合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法固相亚磷酸液三酯法原理设原理设计的计的第三十七页，讲稿共六十六页哦化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成的单元操作O
45、HGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMTDMT：二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基激活激活激活激活缩合缩合缩合缩合氧化氧化氧化氧化脱取代基脱取代基脱取代基脱取代基玻璃珠玻璃珠玻璃珠玻璃珠连接臂连接臂连接臂连接臂第三十八页，讲稿共六十六页哦DNADNA化学合成的用途化学合成的用途化学合成的用途化学合成的用途合成天然基因合成天然基因合成天然基因合成天然基因修饰改造基因修饰改造基因修饰改造基因修饰改造基因 设计新型基因设计新型基因设计新型基因设计新型基因 制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头 如生
46、长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等干扰素基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 第三十九页，讲稿共六十六页哦二二DNADNA片段与载体片段与载体DNADNA体外重组体外重组 外原基因（外原基因（外原基因（外原基因（DNADNA片段）片段）片段）片段）很难很难很难很难直接透过受体细胞的细胞直接透过受体细胞的细胞直接透过受体细胞的细胞直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到限制性内切酶膜进入受体细胞，即使进入，也会受到限制性内切酶膜进入受体细胞，即使进入，也
47、会受到限制性内切酶膜进入受体细胞，即使进入，也会受到限制性内切酶的作用而分解。的作用而分解。的作用而分解。的作用而分解。要将外源基因导入受体细胞，必须要将外源基因导入受体细胞，必须要将外源基因导入受体细胞，必须要将外源基因导入受体细胞，必须选择适当的载体选择适当的载体选择适当的载体选择适当的载体。第四十页，讲稿共六十六页哦作为载体的作为载体的作为载体的作为载体的DNADNADNADNA分子所分子所分子所分子所具备的条件：具备的条件：具备的条件：具备的条件：1 1 1 1、容易进入寄主细胞、容易进入寄主细胞、容易进入寄主细胞、容易进入寄主细胞 2 2 2 2、进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制
48、和表达。、进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达。、进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达。、进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达。3 3 3 3、容易从宿主细胞中分离纯化、容易从宿主细胞中分离纯化、容易从宿主细胞中分离纯化、容易从宿主细胞中分离纯化 常用的载体：常用的载体：常用的载体：常用的载体：质粒、噬菌体、病毒和粘粒质粒、噬菌体、病毒和粘粒质粒、噬菌体、病毒和粘粒质粒、噬菌体、病毒和粘粒载体是外源基因进入受体细胞的工具。载体是外源基因进入受体细胞的工具。第四十一页，讲稿共六十六页哦DNA重组技术重组技术核心步骤：核心步骤：DNADNADNADNA片段的体外连接片段的体外连接
49、片段的体外连接片段的体外连接本质：本质：涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程 载体：载体：载体：载体：质粒和温和噬菌体质粒和温和噬菌体 需两大酶：需两大酶：需两大酶：需两大酶：DNADNADNADNA限制性内切酶和限制性内切酶和限制性内切酶和限制性内切酶和DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 此外：此外：此外：此外：DNADNA聚合酶、逆转录酶、聚合酶、逆转录酶、聚合酶、逆转录酶、聚合酶、逆转录酶、DNADNA修饰酶、修饰酶、修饰酶、修饰酶、RNARNARNARNA修饰修饰酶、核酸外切酶、碱
50、性磷酸酶等酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等第四十二页，讲稿共六十六页哦目的目的DNA片段被限制性内切酶消化后片段被限制性内切酶消化后其末端可能有其末端可能有3种形式：种形式：带有相同的粘性末端带有相同的粘性末端带有互补的粘性末端带有互补的粘性末端带有平末端带有平末端第四十三页，讲稿共六十六页哦(1)粘粘性性末末端端的的连连接接第四十四页，讲稿共六十六页哦(2)平平末末端端的的连连接接第四十五页，讲稿共六十六页哦三三DNADNA重组体转入受体细胞重组体转入受体细胞 1 1 1 1受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞 (特点特点特点特点)(1)(1)转化率高转化率高 (2)(2)保持质粒稳定保持质粒稳定