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1、第二章第二节基因工程四要素第1页，共67页，编辑于2022年，星期三四大要素解决四大要素解决5 5大操作元件的几大操作元件的几个问题个问题1、用什么来、用什么来”切切“？”切切“什么？什么？2、用什么来、用什么来”接接“？”接接“什么？什么？3、”转转“入哪里？入哪里？4、怎样、怎样“增增”？5、怎样、怎样“检检”？第2页，共67页，编辑于2022年，星期三人工合成、酶切、人工合成、酶切、PCRPCR、文库、文库、cRNAcRNA重组产物重组产物目的基因目的基因克隆载体克隆载体连接连接重组重组DNADNA分子分子细菌中原核表达细菌中原核表达在植物中表在植物中表达（转基因达（转基因植物）植物）在
2、酵母中在酵母中表达表达病毒中表达病毒中表达分离纯化分离纯化上上游游技技术术下下游游技技术术酶切酶切酶酶切切转化转化感受态感受态宿主细胞宿主细胞目的基因被克隆目的基因被克隆增殖增殖构建其构建其表达载体表达载体转化感受态宿转化感受态宿主细胞主细胞PCRPCR和酶和酶切鉴定切鉴定SouthernSouthernNorthernNorthernWesternWestern 筛选筛选检测检测鉴定鉴定第3页，共67页，编辑于2022年，星期三操作单操作单元元操作对象操作对象所用工具或方所用工具或方法法切切载体载体目的基因目的基因工具酶工具酶接接载体载体目的基因目的基因工具酶工具酶转转转转目的基因目的基因入
3、入受体细胞受体细胞（宿主细胞）（宿主细胞）物理或化学方物理或化学方法法增增体内体体内体外外受体细胞受体细胞中的目的基因中的目的基因受体细胞的培受体细胞的培养养检检受体细胞受体细胞中的目的基因中的目的基因Southern工具酶工具酶载体载体目的基因目的基因受体受体四大四大要素要素第4页，共67页，编辑于2022年，星期三一、工具酶一、工具酶（一）（一）限制性限制性内切内切核酸酶核酸酶 P211、概念、概念 一类能识别双链一类能识别双链DNADNA中中特殊核苷酸特殊核苷酸序列，并在合适的反应序列，并在合适的反应条件下使每条链条件下使每条链一定位点一定位点上的磷酸二酯键断开，产生上的磷酸二酯键断开，
4、产生具有具有3-OH3-OH和和5-P5-P基团的基团的DNADNA片段的内切脱氧核糖核片段的内切脱氧核糖核酸酶。酸酶。限制与修饰系统：限制与修饰系统：限制（限制（Restriction）将侵入细菌体内的外源将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断切成小片断;修饰修饰（Modification）细菌自身的细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割自身的限制性内切酶识别切割第5页，共67页，编辑于2022年，星期三第6页，共67页，编辑于2022年，星期三由由19731973年年H.O SmithH.O Smith和和D.N
5、athansD.Nathans提议的命名系统提议的命名系统由三部分构成，即由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序菌种名、菌系编号、分离顺序。1 1、用酶源生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组、用酶源生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成成3 3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coliEscherichia coli）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae）用）用HinHin表示。表示。
6、2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如EcoR I，EcoR V。命名原则？命名原则？P21第7页，共67页，编辑于2022年，星期三第8页，共67页，编辑于2022年，星期三目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶I 类限制性内切酶II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 限制与修饰系统的种类？限制与修饰系统的种类？P21第9页，共67页，编辑于2022年，星期三识别的长度切割的位点P22识别的结构2、限制性内切核酸酶识别序列、限制性内切核酸酶识别序列P21书写：以书写：以5 3”5
7、3”走向的单链走向的单链DNADNA核苷酸表示核苷酸表示左右互补第10页，共67页，编辑于2022年，星期三同裂酶：P22来源不同，来源不同，识别序列相同，识别序列相同，酶切位点相同或不同。酶切位点相同或不同。第11页，共67页，编辑于2022年，星期三 G A A T T CC T T A A GGC T T A A1 1、黏性末端：、黏性末端：被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（正好互补配对。（55粘性和粘性和33粘性）粘性）A A T T C G3、切切割割方方式式P2
8、2第12页，共67页，编辑于2022年，星期三第13页，共67页，编辑于2022年，星期三第14页，共67页，编辑于2022年，星期三同尾酶：同尾酶：P22P22内切酶切割的位点不同，但具有相同的黏性末端，这一组酶成为同尾酶。第15页，共67页，编辑于2022年，星期三平末端：平末端：第16页，共67页，编辑于2022年，星期三4 4、应用、应用（1 1）限制酶切割位点提供了）限制酶切割位点提供了DNADNA物理图物理图谱的特异性标记谱的特异性标记（2 2）酶切产生的特异性片段可用分子克）酶切产生的特异性片段可用分子克隆的手段加以纯化隆的手段加以纯化（3 3）酶切产生的片段为各种各样的其他）酶
9、切产生的片段为各种各样的其他DNADNA酶学操作提供了基本底物。酶学操作提供了基本底物。第17页，共67页，编辑于2022年，星期三5 5、DNADNA末端长度对限制酶切割的影响末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割限制酶切割DNA时对识别序列两时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求端的非识别序列有长度的要求对引物设计的指导：对引物设计的指导：在引在引物末端加上一定数目的物末端加上一定数目的碱基数目碱基数目体现内切的特征加尾操作第18页，共67页，编辑于2022年，星期三(二二)DNA)DNA连接酶连接酶:P25:P25作用：可以把两种来源的作用：可以把两种来源的DNADNA（用同一种限制（用
10、同一种限制 酶切割）的黏性末端黏合起来。（以下酶切割）的黏性末端黏合起来。（以下几种情况）几种情况）同裂酶，行不？P25失去了两种酶的识别序列酶的识别序列仍存在第19页，共67页，编辑于2022年，星期三35磷酸二酯键磷酸二酯键第20页，共67页，编辑于2022年，星期三两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端（2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐平末端功用：DNA重组中促使载体与DNA连接第21页，共67页，编辑于2022年，星期三限制性内切酶限制性内切酶主要用于主要用于DNADNA分子的特异分子的特异切割（切割（“分子剪刀分子剪刀”或或“分子手术刀分子手术刀”“基因刀基因
11、刀”之称之称）核酸连接酶核酸连接酶用于用于DNADNA和和RNARNA的连接的连接第22页，共67页，编辑于2022年，星期三（三）其它工具酶：（三）其它工具酶：1 1、甲基化酶：、甲基化酶：-来自细菌防御系统来自细菌防御系统甲基化对限制酶切的影响甲基化对限制酶切的影响（1 1）、修饰酶切位点）、修饰酶切位点-使本可被酶切的不受酶切使本可被酶切的不受酶切（2)2)、产生新的酶切位点使本不能被酶切的、产生新的酶切位点使本不能被酶切的能被酶切能被酶切(3)(3)、对基因组作图的影响、对基因组作图的影响第23页，共67页，编辑于2022年，星期三2 2、DNADNA聚合酶聚合酶(DNA polyme
12、rase)(DNA polymerase)来自来自DNADNA复制系统复制系统催化催化DNADNA的合成活性（主要活性）：的合成活性（主要活性）：把把dNTPsdNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的 3OH 3OH端，端，催化核苷酸的聚合作用。（聚合酶的共催化核苷酸的聚合作用。（聚合酶的共同特点）同特点）其他活性（相辅助的活性）其他活性（相辅助的活性）第24页，共67页，编辑于2022年，星期三3、耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶来源：来源：噬高温的细菌。噬高温的细菌。基本特性：基本特性：在高温下具有活性（在高温下具有活性（90-90-100100）用途：用途：主要用于主要用于PCRPCR
13、第25页，共67页，编辑于2022年，星期三4、反转录酶（反转录酶（reverse reverse transcriptasetranscriptase）依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（以聚合酶（以RNARNA为模板）为模板）基本特性：基本特性：5 5 33合成合成DNADNA活性，但无活性，但无3 3 55外切酶活性外切酶活性主要用途：主要用途：cDNAcDNA克隆中合成第一条链克隆中合成第一条链/提取提取RNARNA反转反转录成录成DNADNA，再，再PCRPCR（因为内含子的存在）（因为内含子的存在）转录酶-RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或R
14、NA为模板催化由核苷-5-三磷酸合成RNA的酶。在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关第26页，共67页，编辑于2022年，星期三5、末端转移酶末端转移酶来源：小牛胸腺来源：小牛胸腺基本特性：不依赖于模板的基本特性：不依赖于模板的DNADNA聚合酶。聚合酶。应用：应用：P26P26平末端平末端粘性末端粘性末端第27页，共67页，编辑于2022年，星期三6 6、核酸外切酶、核酸外切酶exonuclease（与核酸内切酶相对应）一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3 3、5-5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。
15、其水解的最终产物是单个的核苷酸（产物是单个的核苷酸（DNADNA为为dNTPdNTP，RNARNA为为NTPNTP）。）。（作用于（作用于DNADNA或或RNARNA）第28页，共67页，编辑于2022年，星期三单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶能够从能够从5-5-末端或末端或3-3-末端呈单链状态的末端呈单链状态的DNADNA分分子上降解子上降解DNADNA，产生出，产生出寡核苷酸寡核苷酸短片段，而且短片段，而且是唯一不需要是唯一不需要Mg2+Mg2+离子的活性离子的活性酶酶，是一种，是一种耐受性很强的耐受性很强的核酸酶核酸酶。可以用来测定基因组可以用来测定
16、基因组DNA中一些特殊的间隔序中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的的DNA分子。分子。主要的催化活性是催化双链主要的催化活性是催化双链DNADNA按按3535的方向从的方向从3-3-OHOH末端释放末端释放5-5-单核苷酸。单核苷酸。第29页，共67页，编辑于2022年，星期三基因工程应用：基因工程应用：P26P26粘性末端粘性末端平末端平末端第30页，共67页，编辑于2022年，星期三7 7、碱性磷酸酯酶：、碱性磷酸酯酶：alkaline phosphatasealkaline phosphatase最适最适pHpH在在7.
17、07.0以上，催化各种磷酸单酯键以上，催化各种磷酸单酯键水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖的酶，也可以催化磷酸基团的转酚或糖的酶，也可以催化磷酸基团的转移反应，但不能水解磷酸二酯键。移反应，但不能水解磷酸二酯键。应用：应用：P26 P26 第31页，共67页，编辑于2022年，星期三8 8、RNARNA酶酶RNaseRNase：RNaseRNase的特点：的特点：抗酸抗碱抗酸抗碱,具很广具很广pHpH作用范围作用范围抗高温严寒抗高温严寒(065(065均具活性，均具活性，100100也不能使之完全失活）也不能使之完全失活）抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活
18、，去除变性剂后又可恢复抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）活性）酶活性不需要辅助因子酶活性不需要辅助因子存在范围广存在范围广 第32页，共67页，编辑于2022年，星期三总之总之限制性内切酶限制性内切酶主要用于主要用于DNADNA分子的特异切割分子的特异切割 DNADNA甲基化酶甲基化酶用于用于DNADNA分子的甲基化分子的甲基化 核酸外切酶核酸外切酶用于用于DNADNA和和RNARNA的非特异性切割的非特异性切割 核酸聚合酶核酸聚合酶用于用于DNADNA和和RNARNA的合成的合成 核酸连接酶核酸连接酶用于用于DNADNA和和RNARNA的连接的连接 核酸末端修饰酶核
19、酸末端修饰酶用于用于DNADNA和和RNARNA的末端修饰的末端修饰 RNA RNA酶酶-分解分解RNARNA其它酶类其它酶类-用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等第33页，共67页，编辑于2022年，星期三1 1、载体：、载体：将将外源外源DNADNA或基因或基因携带入携带入适当适当宿宿主细胞（主细胞（host cellhost cell）的工具。）的工具。二、基因克隆载体二、基因克隆载体P27P27第34页，共67页，编辑于2022年，星期三2、载体的种类、载体的种类克隆载体：克隆载体：携带重组携带重组DNADNA进入在宿主细胞内进行大量复制
20、进入在宿主细胞内进行大量复制 形成大量的基因形成大量的基因克隆。克隆。被克隆的基因不一定会表达被克隆的基因不一定会表达 但一定被大量复制但一定被大量复制 质粒载体质粒载体复制起点来自一些天然质粒。复制起点来自一些天然质粒。噬菌体载体噬菌体载体，P1P1和和M13M13、fdfd载体，复制起点来自噬菌体。载体，复制起点来自噬菌体。人工染色体载体人工染色体载体P33P33：大大DNADNA片段克隆载体片段克隆载体 表达载体：表达载体：使目的基因表达，生产出我们需要的产物。使目的基因表达，生产出我们需要的产物。第35页，共67页，编辑于2022年，星期三2 2、载体具备的条件载体具备的条件l 具有较
21、高的拷贝数染色体复制起点染色体复制起点染色体外复制起点染色体外复制起点质粒质粒复制起点具种的复制起点具种的特异性特异性分子量过大分子量过大可转移性低可转移性低利于载体的制备利于载体的制备以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞或筛选作用多克隆多克隆位点位点第36页，共67页，编辑于2022年，星期三(掌握质粒载体，了解病毒克隆载体、人工染色体掌握质粒载体，了解病毒克隆载体、人工染色体载体载体P28-35)你对天然质粒了解多少？你对天然质粒了解多少？第37页，共67页，编辑于2022年，星期三（1 1）可转移性）可转移性F质粒：F因子或性因子R质粒：抗药性因子Col质粒：大肠杆菌素因子第38页
22、，共67页，编辑于2022年，星期三（2 2）自主复制性）自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系第39页，共67页，编辑于2022年，星期三（3 3）质粒的拷贝数）质粒的拷贝数根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒：严紧型复制控制的质粒：1-3 1-3 拷贝，属低拷贝型，受拷贝，属低拷贝型，受宿主染色体基因控制宿主染色体基因
23、控制松弛型复制控制的质粒：松弛型复制控制的质粒：10-60 10-60 拷贝，属高拷贝型，受拷贝，属高拷贝型，受宿主染色体基因控制较弱宿主染色体基因控制较弱第40页，共67页，编辑于2022年，星期三（4）标记基因）标记基因A A、选择标记基因、选择标记基因用于鉴别、指示目的用于鉴别、指示目的DNADNA（载体）是否进入了（载体）是否进入了宿主细胞（有可能是空载）宿主细胞（有可能是空载）P2745 。抗生素抗性基因，使用最广泛。抗生素抗性基因，使用最广泛。a.a.氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（AmpAmpr r）杀杀菌菌剂剂，AmpicillinAmpicillin可可抑抑制制细细菌
24、菌细细胞胞膜膜上上参参与与细细胞胞壁壁合合成成酶酶类类的的活活性性，干干扰细胞分裂，杀死细胞。扰细胞分裂，杀死细胞。AmpAmpr r抗抗性性基基因因编编码码一一种种分分泌泌到到细细菌菌细细胞胞周周间间质质的的酶酶，催催化化内内酰酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。胺环的水解，使氨苄青霉素失活。第41页，共67页，编辑于2022年，星期三b.b.四环素抗性基因（四环素抗性基因（TetTetr r）抑抑菌菌剂剂，Tetracycline Tetracycline 可可结结合合在在核核糖糖体体30s30s亚亚基基中中的的一一种种蛋蛋白白质质分分子子上上，抑抑制制核核糖糖体体的的转转位位过过程程。抑抑制
25、制细细胞胞蛋白质合成，细胞停止生长。蛋白质合成，细胞停止生长。四环素抗性基因编码一种四环素抗性基因编码一种399 AAs399 AAs蛋白质，与细菌细胞蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。第42页，共67页，编辑于2022年，星期三c.c.氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（CmCmr r）抑抑菌菌剂剂，ChlorophenicolChlorophenicol可可结结合合在在核核糖糖体体50 50 S S亚基上，阻止蛋白质合成。亚基上，阻止蛋白质合成。Cm Cmr r基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，
26、导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。第43页，共67页，编辑于2022年，星期三d.d.卡那霉素卡那霉素(Kan(Kanr r)、新霉素新霉素(Neo(Neor r)、G418G418抗性基抗性基因因(G418(G418r r)杀杀菌菌剂剂，KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均均属属脱脱氧氧链链霉霉胺胺氨氨基基葡葡萄萄糖糖苷苷类类抗抗生生素素，可可结结合合在在核核糖糖体体上上，导致导致mRNAmRNA发生错读。发生错读。来来自自转转座座子子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr
27、 r抗抗性性基基因因均均可可使使这这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。第44页，共67页，编辑于2022年，星期三B B、筛选标记基因（检测性标记基因）、筛选标记基因（检测性标记基因）用于指示外源用于指示外源DNADNA分子是否插入载体分子分子是否插入载体分子形成了重组子（思考：空载是否生长的形成了重组子（思考：空载是否生长的问题？）。问题？）。P27/47P27/47第45页，共67页，编辑于2022年，星期三（1）lac Z标记基因-互补：互补：lac Z基因上缺失近操纵基因区段（见下图）（见下图）的突变体与带有完整的近操纵基因区段的半乳糖苷酶基因的突
28、变体之间实现互补。半乳糖苷酶基因编码半乳糖苷酶基因编码10211021个个 氨基酸氨基酸 其氨基末端称为其氨基末端称为链，羧基末端称为链，羧基末端称为链链 链负责将链负责将链装配为四聚体链装配为四聚体 单独的单独的链不具酶活性，只有在链不具酶活性，只有在链的帮助下链的帮助下组装成组装成44才具有酶活性才具有酶活性-互补作用互补作用 为为链编码的基因称之为链编码的基因称之为lacZ(lacZ(编码编码146 AAs)146 AAs)载体：许多载体都具有一段大肠杆菌载体：许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其编码半乳糖苷酶的启动子及其编码肽链（氨基端）的肽链（氨基端）的DNADNA序列序
29、列lacZlacZ基因。基因。肽链即是肽链即是半乳糖半乳糖苷酶氨基端的短片段苷酶氨基端的短片段宿主细胞：含有可编码宿主细胞：含有可编码肽链（肽链（N N端）的端）的DNADNA序列序列lacZlacZ基因基因+肽链肽链+肽链肽链 半乳糖苷酶有活半乳糖苷酶有活性性IPTG/x-gal蓝色菌斑重组载体重组载体+宿宿主细胞主细胞无肽链，肽链，仅仅肽链肽链 半乳糖半乳糖苷酶无活性苷酶无活性IPTG/x-gal白色白色菌斑菌斑载体转入宿主细胞后第46页，共67页，编辑于2022年，星期三调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAMP复合
30、物复合物mRNAmRNA+-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰半乳糖苷乙酰基转移酶酶基转移酶酶第47页，共67页，编辑于2022年，星期三第48页，共67页，编辑于2022年，星期三第49页，共67页，编辑于2022年，星期三第50页，共67页，编辑于2022年，星期三外源基因外源基因抗Amp抗Tet抗抗AmpAmp抗抗AmpAmp抗抗TetTet抗抗TetTet重组重组DNADNA空载体空载体不含有载体或重不含有载体或重组组DNADNA第51页，共67页，编辑于2022年，星期三筛筛选选重重组组子子的的示示意意图图怎样得到含重组子怎样得到含重组子的菌？的菌？第5
31、2页，共67页，编辑于2022年，星期三Amp rTet rTet rAmp sPstI.涂布有涂布有Tet的培养基的培养基涂布有涂布有Amp的培养基的培养基.重组体的筛选重组体的筛选外源基因的插入：外源基因的插入：.第53页，共67页，编辑于2022年，星期三3、葡萄糖苷酸酶基因（GUS）许多生物中没有许多生物中没有GUSGUS基因，基因，95%的大肠杆菌具有的大肠杆菌具有GUSGUS基因基因。GUS基因作为载体的标记基因，可将底物X-Gluc（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡萄糖苷）葡萄糖苷）降解为兰色产物。应用：A.A.用于快速检测植物中用于快速检测植物中GUSGUS基因融合标记
32、。检测本底没有基因融合标记。检测本底没有GUSGUS基因基因的生物（植物），重组子转入植物后，载体上的的生物（植物），重组子转入植物后，载体上的GUSGUS基因产生的葡萄糖苷基因产生的葡萄糖苷酸酶能将加入的底物酸酶能将加入的底物X-GlucX-Gluc降解为兰色产物，而对照没有。降解为兰色产物，而对照没有。B.B.用用X-GlucX-Gluc这种发色底物的培养基可以检测以及定量食品样本如肉、奶制品以及贝这种发色底物的培养基可以检测以及定量食品样本如肉、奶制品以及贝类中的大肠杆菌数量。国际上普遍采用该产品取代传统方法以精确检测类中的大肠杆菌数量。国际上普遍采用该产品取代传统方法以精确检测饮用水中
33、的大肠杆菌数量，该方法大大降低了假阳性和假阴性。饮用水中的大肠杆菌数量，该方法大大降低了假阳性和假阴性。第54页，共67页，编辑于2022年，星期三总之，一个克隆载体至少有一个以上的总之，一个克隆载体至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一个用克隆位点和两个标记基因，其中一个用于转化体（重组子和空载）选择，一个于转化体（重组子和空载）选择，一个用于重组子检测。用于重组子检测。第55页，共67页，编辑于2022年，星期三3、载体的功能、载体的功能运送外源基因运送外源基因高效高效转入受体细胞转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的为外源基因的扩
34、增或表达扩增或表达提供必要的条件提供必要的条件第56页，共67页，编辑于2022年，星期三质粒载体的一般特征质粒载体的一般特征染色体DNA质粒DNA大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞第57页，共67页，编辑于2022年，星期三第58页，共67页，编辑于2022年，星期三4 4、质粒的改造构建、质粒的改造构建删除非必需区：删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外源减小质粒的分子量，提高外源DNADNA的的装载量装载量(一般来说，大于一般来说，大于20kb20kb的质粒很难导入受体细胞的质粒很难导入受体细胞)加入新的遗传标记基因。加入新的遗传标记基因。引入具有多种限制酶识别及切割位点的引入具有多种限制酶识别及
35、切割位点的DNADNA序列：序列：即多克隆位点即多克隆位点(multiple cloning sites(multiple cloning sites，MCS)MCS)。插入特殊的基因表达调控序列。插入特殊的基因表达调控序列。第59页，共67页，编辑于2022年，星期三第60页，共67页，编辑于2022年，星期三由由pBR322pBR322与与M13M13噬菌体改建而成噬菌体改建而成分子量更分子量更小小拷贝数拷贝数增加增加哪两个标记基因？第61页，共67页，编辑于2022年，星期三其它载体：其它载体：病毒（噬菌体载体）病毒（噬菌体载体）P30P30，P1P1和和M13M13、fdfd载体，载体
36、，复制起点来自噬菌体复制起点来自噬菌体 COSCOS质粒载体质粒载体质粒载体中插入质粒载体中插入coscos片段，以利片段，以利于体外包装于体外包装 噬菌粒载体噬菌粒载体（phagemidphagemid）有质粒和有质粒和M13M13、fdfd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制人工染色体载体人工染色体载体大大DNADNA片段克隆载体片段克隆载体P33P33体内同源重组整合载体体内同源重组整合载体-P35-P35第62页，共67页，编辑于2022年，星期三三、目的基因三、目的基因（一）定义：（一）定义：目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定目的基
37、因含义：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或基因或DNADNA片段，能编码某一产物或某一性状。片段，能编码某一产物或某一性状。-基因的编码基因的编码区、也可是包含启动子和终止子的功能基因、完整的操纵子、区、也可是包含启动子和终止子的功能基因、完整的操纵子、几个操纵子聚集的基因簇、启动子或终止子元件几个操纵子聚集的基因簇、启动子或终止子元件（二）来源（二）来源 ：来源于各种生物，其中主要是真核生物如来源于各种生物，其中主要是真核生物如 人和动物。人和动物。第63页，共67页，编辑于2022年，星期三（三）目的基因获得途径（三）目的基因获得途径1 1 酶切法酶切法2 PCR2 PCR扩增
38、扩增DNADNA前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物引物 3 3 化学合成目的基因化学合成目的基因-（方法：不要求）（方法：不要求）DNADNA片段很长片段很长 第64页，共67页，编辑于2022年，星期三4 4、通过构建基因文库或、通过构建基因文库或cDNAcDNA文库分离目的基因文库分离目的基因基因文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储基因文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。组文库。cDNA
39、cDNA文库：某种生物基因组转录的全部文库：某种生物基因组转录的全部mRNAmRNA经反转录产生的各种经反转录产生的各种cDNAcDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆子群体之片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为中，这样的群体称为cDNAcDNA文库文库第65页，共67页，编辑于2022年，星期三四、受体细胞四、受体细胞1 1、含义、含义 所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源DNADNA（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应
40、用价值和理论研究价值的细胞。用价值和理论研究价值的细胞。2 2、种类：、种类：原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是原胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是原核生物细胞。核生物细胞。第66页，共67页，编辑于2022年，星期三原因：原因：大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源源DNADNA的进入的进入 没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNADNA没有固定结合的蛋白质，这为外源没有固定结合的蛋白质，这为外源DNADNA与与裸露的染色体裸露的染色体DNADNA重组减少麻烦重组减少麻烦 基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析便于对引入的外源基因进行遗传分析 原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快第67页，共67页，编辑于2022年，星期三