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1、细胞工程动物细胞培养第1页，此课件共54页哦（1）原代培养与传代培养）原代培养与传代培养 第2页，此课件共54页哦1取材取材TrypsinEDTAcollagenase取材部位是否准确组织是否保持活性材料处理是否恰当第3页，此课件共54页哦2 原代培养原代培养组织块培养组织块培养组织块的培养第4页，此课件共54页哦3 传代培养传代培养消化法消化法第5页，此课件共54页哦一般传代培养的步骤一般传代培养的步骤(1)吸出培养瓶内旧培养液。吸出培养瓶内旧培养液。(2)加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。混合液盖满瓶底。(3)25分钟后检查，如有细胞间隙变大，细分钟后检查，如有细胞间隙变
2、大，细胞质回缩现象，终止消化。胞质回缩现象，终止消化。(4)吸出消化液，加入吸出消化液，加入PBS液，轻轻转动以液，轻轻转动以免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。用胰蛋白酶，可直接加入培养液。(5)用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度。液，计数后记录其浓度。（6）重新接种培养。）重新接种培养。第6页，此课件共54页哦（二）建立细胞系过程（二）建立细胞系过程第7页，此课件共54页哦肿瘤细胞的体外培养与建系过程肿瘤细胞的体外培养与建系过程以人上皮型食管癌以人上皮型食管癌109细
3、胞系的建立细胞系的建立为为例介绍一下具体的建系过程：例介绍一下具体的建系过程：第8页，此课件共54页哦（1）取材）取材食管癌患者的手术标本食管癌患者的手术标本第9页，此课件共54页哦（2）原代培养）原代培养1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的 RPMI 1640培养液内，于培养液内，于4下静置下静置2小小时。时。2）然后将组织剪切成然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含的小块。用含青霉素和链霉素的青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗培养液洗涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中。养瓶中。3）于于37、CO2培养
4、箱内培养培养箱内培养2小时后，再小时后，再 补加含补加含20%的小牛血清的的小牛血清的RPMI 1640培培养液，继续培养。养液，继续培养。第10页，此课件共54页哦（3）建系过程）建系过程组织块在接种组织块在接种1周后，周后，上皮细胞上皮细胞从组织块周围向外迅从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到周后，可以见到成成纤维细胞纤维细胞生长。生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。快，并向周围延伸。用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞胞。这样处理后的细胞在
5、传代三次后，贴壁生长的细。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。周后细胞形成群落。第第4代后细胞开始呈单层生长，命名为代后细胞开始呈单层生长，命名为ECA109。ECA109 经生物学特性分析后确定细胞系建立成功经生物学特性分析后确定细胞系建立成功第11页，此课件共54页哦建立细胞系的要求建立细胞系的要求国际上对Certified cell的确定尚无统一标准1 组织来源2 细胞生物学检测：形态，特异结构，细胞生长曲线，分裂指数，接种率，特异性如腺细胞，肿瘤细胞3 培养条件和方法第12页，此课件共54页哦（三）细
6、胞系和细胞株鉴定鉴定指标：纯度，细胞学特性，稳定性，污染情况鉴定方法：细胞形态学观察，绘制生长曲线，计算分裂指数，染色体组型和带型分析，同工酶酶谱检测档案资料及管理使用：美国标准细胞库ATCC,人遗传突变细胞库HGMR,细胞衰老细胞库CAR第13页，此课件共54页哦细胞计数细胞计数四角大方格内细胞数平均，若压中线者，只计算压左线和上线边的细胞。细胞密度个/ml平均细胞数x103x稀释倍数第14页，此课件共54页哦培养细胞活力测定培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。一。任任何何培培养养瓶瓶内内生生长长的的细细胞胞都都
7、由由死死细细胞胞和和活活细细胞胞组组成成，从从形形态态上区别死、活细胞是困难的。上区别死、活细胞是困难的。1 细胞克隆形成率实验细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数克隆形成率比克隆形成数接种细胞数缺点：操作繁琐缺点：操作繁琐优点：精确、可靠优点：精确、可靠第15页，此课件共54页哦2.台盼蓝法台盼蓝法活活细细胞胞不不被被染染色色，死死细细胞胞染染成成蓝蓝色色，用用活活细细胞胞占占
8、细细胞胞中中的的百百分分比比表表示示细细胞胞活力活力 第16页，此课件共54页哦3 四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法四唑盐（四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，）商品名为噻唑蓝，原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定量成正比。再用酶标仪测定
9、OD值值MTT法简单快速准确，广泛应用于新药筛选、法简单快速准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。第17页，此课件共54页哦 （1）单细胞悬液接种于）单细胞悬液接种于96孔培养板；孔培养板；103-104 细细胞胞/孔，每孔培养基总量孔，每孔培养基总量200ul（96孔培养板每孔容积孔培养板每孔容积370ul），），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）据实验目的决定培养时间）（2）加入）加入2mgml的的MTT液（液（50ul孔）；继孔）；继续培养续培养3小时。小时。（3）吸出孔内培养
10、液后，加入）吸出孔内培养液后，加入DMSO液液（150ul孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔）酶标仪检测各孔OD值（检测波长值（检测波长570nm），），记录结果，绘制生长曲线。记录结果，绘制生长曲线。操作步骤操作步骤:第18页，此课件共54页哦（四）细胞冻存和复苏（四）细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
11、细胞生物学特性变化。第19页，此课件共54页哦第20页，此课件共54页哦液氮罐第21页，此课件共54页哦CryopreservationHow does freezing induce damage?cool too fast formation of ice crystals inside the cell cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice
12、growth Thawing rate is also important(thaw rapidly)最适度以下的最适度以上的第22页，此课件共54页哦慢冻程序慢冻程序标准程序：标准程序：当温度在当温度在-25 以上时，以上时，12/min 当温度达当温度达-25 以下时，以下时，510/min 当温度达当温度达-100时，可迅速放入液氮中细胞冻存器时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：简易程序：将将冷冷冻冻管管（管管口口要要朝朝上上）放放入入纱纱布布袋袋内内，纱纱布布袋袋系系以以线线绳绳，通通过过线线绳绳将将纱纱布布袋袋固固定定于于液液氮氮罐罐罐罐口口，按按每每分分钟钟温温度度下下降降12
13、 的的速速度度，在在40分分钟钟内内降降至至液液氮氮表表面面，停停30分分钟钟后后，直直接接投投人液氮中。人液氮中。第23页，此课件共54页哦低温保护剂的应用低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。果。常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从透出细胞外，在胞外形成冰晶，减
14、少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。而减少冰晶对细胞的损伤。第24页，此课件共54页哦细胞冻存方法细胞冻存方法1 预先配制冻存液：预先配制冻存液：含含20%血清培养基血清培养基10%DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞细胞/ml)3 加入加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。冻细胞名称和冷冻日期。4 存活率可达存活率可达80一一90。DMSO液用培液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害养液配好，避免因
15、临时配制产热而伤害细胞。细胞。第25页，此课件共54页哦细胞复苏方法细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（1分钟左右）。分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的10倍倍以上。以上。（3）低速离心）低速离心10分钟。分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。胞。第26页，此课件共54页哦1 基本流程基本流程分批式batch，流加式fed-batch，半连续式semicontinuous，连续式，灌流式perfusion（五）动物细胞大
16、规模培养（五）动物细胞大规模培养第27页，此课件共54页哦2 生物反应器系统生物反应器系统第28页，此课件共54页哦（1）生物反应器）生物反应器设计依据除了以人工诱变为目的的培养外，用于除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。由于动物细胞生长的特殊性，长环境。由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。特殊载体的选择。第29页
17、，此课件共54页哦（2）分类）分类一般有微载体式、中空纤维式、灌注一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等几种新型的反应培养式、旋转壁式等几种新型的反应器等器等。第30页，此课件共54页哦分批式操作：早期采用的方式，是其它操作方式的基础。机械搅拌式生物反应器，一次性将扩大的细胞和培养液投入，在培养过程中其体积不变，不添加其它成份，待细胞增长和产物积累到适当时间，一次性一次性对细胞，产物和培养基进行收获。流加式操作：主流优势主流优势。机械搅拌式生物反应器，悬浮培养细胞或以微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/31/2，在培养过程中，根据细胞对营养物质的不断消耗和
18、需求及时补充新的营养成份，使细胞持续生长。细胞或产物达到所需指标后终止培养，一次性回收一次性回收整个反应体系，分离纯化产品。第31页，此课件共54页哦半连续式操作：又称为重复批式培养或换液培养，采用机械搅拌式生物反应器，悬浮培养形式。每隔一定的时间去除部分培养物，再每隔一定的时间去除部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变，并使用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变，并使细胞呈指数生长细胞呈指数生长，可长时期进行生产，反复收获产品。连续式操作：采用机械搅拌式生物反应器，将细胞接种到一定的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达到最大密度之前为了防止衰退期的出
19、现，在细胞达到最大密度之前以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时含有细含有细胞胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，培养体积恒定的培养物以相同的速度连续从反应器流出，培养体积恒定。灌流式操作：把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成的过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又不断地灌注新地培养基。可采用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞和固定床或流化床生物反应器。细胞截留系统维持较高的细胞截留系统维持较高的细胞密度；连续灌流系统使细胞处于较好的营养环境，有害代细胞密度；连续灌流系统使细胞处于较好的营养环境，有害代谢物浓度降低；反应速率
20、易控制；产品在罐内停留时间短，活谢物浓度降低；反应速率易控制；产品在罐内停留时间短，活性好。性好。第32页，此课件共54页哦第33页，此课件共54页哦（3）动物细胞培养的载体动物细胞培养的载体实现规模化急需解决的问题实现规模化急需解决的问题 问题一问题一 细胞贴壁生长的载体细胞贴壁生长的载体第34页，此课件共54页哦微载体培养技术微载体培养技术1967年，年，Van Wezel开发了微载体系统开发了微载体系统培养贴壁细胞。培养贴壁细胞。微载体是直径微载体是直径60-250m的微珠。多用带的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以
21、利于细胞使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。的贴壁及生长。第35页，此课件共54页哦*贴壁培养的载体材料贴壁培养的载体材料 与生物反应器系统与生物反应器系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载微载体系统体系统等。等。后者是一重要技术，包括微载体、多空后者是一重要技术，包括微载体、多空载体、微囊载体、微囊 第36页，此课件共54页哦*一种微载体产品及孔状的显微结构一种微载体产品及孔状的显微结构材料：生物相容性，机械稳定性热稳定性第37页，此课件共54页哦第38页，此课件共54页哦（4）生物反应器培养系统与工艺）生物反应器培养系统与工艺问题二问题二 系统构建
22、系统构建问题三问题三 传代技术传代技术问题四问题四 培养工艺培养工艺第39页，此课件共54页哦与微载体结合的生物反应器系统与微载体结合的生物反应器系统第40页，此课件共54页哦第41页，此课件共54页哦（5）培养工艺）培养工艺连续灌注培养连续灌注培养第42页，此课件共54页哦第43页，此课件共54页哦第44页，此课件共54页哦生长在载体上的动物细胞生长在载体上的动物细胞第45页，此课件共54页哦第46页，此课件共54页哦收获细胞第47页，此课件共54页哦一个问题：一个问题：怎样实现接种传代培养？怎样实现接种传代培养？球传球技术球传球技术第48页，此课件共54页哦（6）应用举例）应用举例生物反应
23、器培养非洲绿猴肾细胞生物反应器培养非洲绿猴肾细胞vero和狂犬病毒和狂犬病毒第49页，此课件共54页哦1 材料与方法材料与方法（1 1）细胞：非洲绿猴肾细胞）细胞：非洲绿猴肾细胞VeroVero细胞细胞(ATCC):(ATCC):150-180 150-180代。代。（2 2）培养基：）培养基：DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium GIBCOL)GIBCOL)，5%5%10%10%小牛血清和硫酸庆大小牛血清和硫酸庆大 霉素，用碳酸氢钠或盐酸调至霉素，用碳酸氢钠或盐酸调至pH7.2pH7.2
24、。（3 3）微载体：微载体：CT-3CT-3微载体微载体（4 4）反应器：）反应器：5LCellGen细胞培养反应器细胞培养反应器 (NBS.CO.U.S.A.)，50LCellCul-50A细胞培养生物反应器细胞培养生物反应器第50页，此课件共54页哦2 培养过程培养过程以以CelliGen5L细胞培养反应器作为种子罐培养，当细胞培养反应器作为种子罐培养，当细胞生长到一定密度时，将细胞和新的微载体一起细胞生长到一定密度时，将细胞和新的微载体一起移入移入CellCul-50A细胞培养反应器中细胞培养反应器中。自动控制：自动控制：温度温度37370.10.1、溶解氧为、溶解氧为50%50%空气饱
25、和度、转速为空气饱和度、转速为202032rpm32rpm。细细胞胞培培养养到到一一定定密密度度后后，接接种种狂狂犬犬病病毒毒。第第2 2天天停停止止搅搅拌拌，抽抽出出培培养养基基，加加病病毒毒培培养养基基继继续续培培养养。病病毒毒培培养养条条件件为为pH7.4pH7.4pH7.8pH7.8、溶溶解解氧氧为为40%40%60%60%空空气饱和度、温度为气饱和度、温度为37.037.0。第51页，此课件共54页哦第52页，此课件共54页哦3 培养结果培养培养8天，细胞密度达天，细胞密度达1.1107cells/ml。细胞贴。细胞贴附在微载体上生长的电镜照附在微载体上生长的电镜照片见图。在整个培养过程中片见图。在整个培养过程中细胞形态饱满光滑、长较快，细胞形态饱满光滑、长较快，细胞在较短的时间内达到高细胞在较短的时间内达到高密度，且可多层生长。接种密度，且可多层生长。接种病毒后病毒后10天，能产生较高天，能产生较高的病毒量。的病毒量。第53页，此课件共54页哦（六）（六）动物细胞体外培养现状与展望动物细胞体外培养现状与展望 第54页，此课件共54页哦