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1、细胞工程Cell EngineeringChapter 4、动物细胞培养工程、动物细胞培养工程 41 概述概述 42 生产用动物细胞系生产用动物细胞系43 培养液和培养环境培养液和培养环境44 动物细胞培养工艺动物细胞培养工艺45 动物细胞培养过程的放大与优化动物细胞培养过程的放大与优化46 动物细胞代谢工程动物细胞代谢工程47 动物细胞工程产品制备及质控动物细胞工程产品制备及质控48 动物细胞工程表达产品的应用动物细胞工程表达产品的应用45 动物细胞培养过程的动物细胞培养过程的 放大与优化放大与优化451 动物细胞培养工艺的研究动物细胞培养工艺的研究A、开发重要性：、开发重要性：真核细胞表达
2、产物糖基化，有疗效；真核细胞表达产物糖基化，有疗效；动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，研发成本高，技术难度大；如：美国，长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公公司，已被司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白药物，药物，2.6g/人、年人、年6154美元美元/g=16000美元，美元，2002年，年，销售额达销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失亿美元，其中，被替代损失10亿，因
3、为产亿，因为产量低，计划投入数亿美元，耗时量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优年，扩大规模、优化生产工艺，提高产量。化生产工艺，提高产量。B、主要内容：、主要内容：生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。C、初步研究：、初步研究：首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细胞培养工艺。胞培养工艺。452 动物细胞培养工艺的优化动物细胞培养工艺的优化A、影响蛋白质产量的关键参数，、影响蛋白质产量的关键参数，营养物耗尽；营养物耗尽；B、决定细胞浓度、决定细胞浓度 有毒废物的积累有毒废物的积累 的关
4、键参数的关键参数 培养物理条件的恶化培养物理条件的恶化 提高蛋白质表达水平提高蛋白质表达水平C、细胞培养工艺、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制细胞新陈代谢的控制 优化策略优化策略 流加工艺的优化流加工艺的优化453 动物细胞培养工艺的放大动物细胞培养工艺的放大A、生物反应器尺寸放大、生物反应器尺寸放大 鼓泡鼓泡B、氧气的传输、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法提高氧气传递的其它方法 搅拌速率和搅拌器的设计搅拌速率和搅拌器的设计C、混合、混合 剪切力和细胞损伤剪切力和细胞损伤D、工业生产中的动物细胞培养、工业生产中的动物细胞培养 46 动物细胞代谢工程动物细胞代谢工程461 概述概述 A、生命的
5、代谢活动、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳，需要对细胞代谢途径进行修饰；，需要对细胞代谢途径进行修饰；B、代谢控制发酵、代谢控制发酵（metabolic control fermentetion）是指利用遗传学或生物化学方法，人是指利用遗传学或生物化学方法，人为地在为地在DNA
6、分子水平上改变和控制微生物分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵；发酵；C、在代谢控制发酵的理论、在代谢控制发酵的理论基础上，提出基础上，提出和形成了和形成了“代谢工程代谢工程”概念；概念；D、代谢工程、代谢工程（也称途径工程，（也称途径工程，pathway engineering）是指应用重组是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的功能，以改
7、变细胞某些方面代谢活性的整套工作功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络有目的地被修饰。有目的地被修饰。462 基本原理基本原理A、代谢网络理论、代谢网络理论细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又互相协调；精密调节，又互相协调；代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据代谢网络分泌处的代谢产物称为节
8、点。根据可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔性节点；性节点；柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；生物合成相关代谢调节和调节网络理论生物合成相关代谢调节和调节网络理论代谢工程代谢工程 代谢流及节点分析代谢流及节点分析 理论涉及理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要内容主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析中心代谢产物作用机制及相关代谢分析B、代谢流及中间产物分析、代谢流及中间产物分析
9、静态分析静态分析C、代谢控制分析、代谢控制分析动态分析动态分析463 代谢调节的基本类型及其机制代谢调节的基本类型及其机制A、代谢调节的基本类型、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制协作式多价反馈控制 合作反馈控制合作反馈控制 累积反馈控制累积反馈控制 顺序反馈控制顺序反馈控制 同工酶控制同工酶控制B、酶合成及酶活性的调节机制、酶合成及酶活性的调节机制 末端代谢产物阻遏末端代谢产物阻遏酶的阻遏酶的阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏酶合成的分解代谢物阻遏和酶的诱导和酶的诱导 酶的诱导与合成酶的诱导与合成 变构变构 酶活性的调节酶活性的调节 同工同工 多功能酶
10、多功能酶 464 代谢工程的研究方法代谢工程的研究方法 A、设计思路改变代谢流、设计思路改变代谢流 扩展代谢途径和构建新的代谢途径扩展代谢途径和构建新的代谢途径 常规方法常规方法分子生物、生化、物化分子生物、生化、物化 代谢通量分析（代谢通量分析（MFA）静态静态B、研究、研究 代谢控制分析（代谢控制分析（MCA）动态动态 方法方法 代谢网络代谢网络 生化系统理论（生化系统理论（BST）最优化原理最优化原理 定量分析定量分析 控制论模型（控制论模型（CM）非线性非线性 途径分析途径分析途径定位途径定位 细胞代谢模型细胞代谢模型C、代谢模型的、代谢模型的 发展与优化发展与优化 神经网络神经网络
11、计算生物学方法计算生物学方法 遗传算法遗传算法 D、逆代谢工程、逆代谢工程 47 动物细胞工程产品制备及质控动物细胞工程产品制备及质控 471 动物细胞工程产品制备动物细胞工程产品制备 A、初级分离、初级分离离心、过滤、吸附离心、过滤、吸附 B、纯化、纯化色谱法色谱法 C、制剂与冷冻干燥、制剂与冷冻干燥472 动物细胞工程产品的质量控制动物细胞工程产品的质量控制 PAGE 纯度纯度 SDS-PAGE 液相色谱液相色谱 A、物化指标测定、物化指标测定 含量含量 B、安全性评介、安全性评介 分子量分子量 C、稳定性、稳定性 48 动物细胞工程表达产品的应用动物细胞工程表达产品的应用 481 重组蛋
12、白药物重组蛋白药物 A、组织型纤溶酶原活化剂（、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体）突变体 Tenecteplase，商品名，商品名TNKaseTM，急性心肌梗死病人溶栓治疗，急性心肌梗死病人溶栓治疗，人人t-PA基因位于基因位于8号染色体号染色体p12-q11.2，全长全长36594bp，14个外显子，个外显子，13个内含子，个内含子，t-PA由由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始个氨基酸，单链糖蛋白，开始 酵母表达，不能分离纯化酵母表达，不能分离纯化 t-PA突变体，由双链糖蛋白，突变体，由双链糖蛋白，现用现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）细胞高效表达成功（参见下图）B、-干扰素（干
13、扰素（IFN-）最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，天然天然IFN-刺激体外培养人成纤维细胞，刺激体外培养人成纤维细胞，大肠杆菌表达，活性低，不稳定，大肠杆菌表达，活性低，不稳定，Cys17形成二硫键，缺少形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化，无糖基化 重组重
14、组IFN-点突变改造，使点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸，变为中性氨基酸，如：丝、酪氨酸，商品名为：如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化，细胞表达，与天然一样，天然糖基化，分离简单。分离简单。C、新型红细胞生成刺激蛋白（、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）D、血友病、血友病缺少凝血因子缺少凝血因子（F）或含量过低疾病）或含量过低疾病482 MAb药物（参见下图）药物（参见下图）因为体内同一抗原具多个表位，刺因为体内同一抗原具多个表位，刺 激机体产生不同抗体（多克隆抗体）激机体产生不同抗体（多克隆抗体）杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具杂交瘤技术能将
15、多克隆抗体纯化为具 有高度均一性，抗原识别专一性的有高度均一性，抗原识别专一性的MAb，降低抗原识别交叉反应；降低抗原识别交叉反应；483基因工程与亚单位疫苗基因工程与亚单位疫苗 A、乙肝疫苗（参见下图）、乙肝疫苗（参见下图）衣壳衣壳衣壳表面抗原（衣壳表面抗原（HBsAg），），核心抗原核心抗原 核心抗原（核心抗原（HBcAg）、）、e抗原（抗原（HBeAg）和核酸）和核酸 第一代疫苗，血中提取，弱反应，第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应，不产生反应，81-82年，美法，年，美法，85年，中国年，中国 第二代疫苗，在哺乳细胞或第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，细胞表达，81年
16、，年，法美，法美，91、92年，中国年，中国 第三代疫苗，第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），抗原（重要作用），CHO细胞表达细胞表达 B、艾滋病疫苗（参见下图）、艾滋病疫苗（参见下图）CHO表达疫苗表达疫苗理论上，有致瘤性理论上，有致瘤性昆虫细胞表达疫苗昆虫细胞表达疫苗昆虫细胞昆虫细胞-杆状病毒表达系统杆状病毒表达系统 （安全性好，容量大，表达效率高）（安全性好，容量大，表达效率高）C、肿瘤疫苗、肿瘤疫苗 灭活自体肿瘤细胞灭活自体肿瘤细胞 对细胞因子基因修饰，对细胞因子基因修饰，主动主动 加强疫苗免疫原性加强疫苗免疫原性 免疫免疫 同种异体的肿瘤细胞同种异体的肿瘤细胞 树突状细胞（抗原提呈
17、细胞）树突状细胞（抗原提呈细胞）体内外诱导体内外诱导CTL生成生成 （细胞毒性（细胞毒性T淋巴细胞）淋巴细胞）激发特异性抗肿瘤免疫功能激发特异性抗肿瘤免疫功能（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名:赫赛汀）赫赛汀）（Zevalin泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，2002年在年在美国上市，被批准用于难治复发美国上市，被批准用于难治复发B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗。）细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗。）484 基因治疗产品基因治疗产品 基因治疗（基因治疗（gene therapy）是指把外界是指把外界的正常基因或治疗基
18、因通过载体转入特定靶的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导，法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导，还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行细胞治疗。细胞治疗。A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：、神经系统疾病的基因或细胞治疗：B、造血干细胞治疗癌症、造血干细胞治疗癌症 HSC基因（参见下图）基因（
19、参见下图）胰岛素依赖型（胰岛素依赖型（I）C、细胞、基因、细胞、基因 代谢代谢 治疗糖尿病治疗糖尿病 紊乱紊乱 非胰岛素依赖型（非胰岛素依赖型（II）【习题习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系：、名词解释，并简要说明它们间关系：单抗与疫苗单抗与疫苗 悬浮培养与贴壁培养悬浮培养与贴壁培养 流加工艺与灌流工艺流加工艺与灌流工艺 CHOCHO与与HNKHNK tPA tPA与与EPOEPO（NESPNESP）艾滋病疫苗与肿瘤疫苗）艾滋病疫苗与肿瘤疫苗基因治疗与细胞治疗基因治疗与细胞治疗 CNTFCNTF与与HSCHSC2 2、简述乙肝疫苗发展历程？试规划肝癌疫苗的简述乙肝疫苗发展历程？试规划肝癌疫苗的发展策略？发展策略？