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1、Chapter 4、动物细胞培养工程、动物细胞培养工程 41 概述概述 42 生产用动物细胞系生产用动物细胞系43 培养液和培养环境培养液和培养环境44 动物细胞培养工艺动物细胞培养工艺45 动物细胞培养过程的放大与优化动物细胞培养过程的放大与优化46 动物细胞代谢工程动物细胞代谢工程47 动物细胞工程产品制备及质控动物细胞工程产品制备及质控48 动物细胞工程表达产品的应用动物细胞工程表达产品的应用41 概述概述 411 定义：定义： 动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动物细胞培养的基本原理，研究生物活细胞为主体的生物细胞培养的基本原理，研究
2、生物活细胞为主体的生物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依托三性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依托三部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术（过渡）和生物反应器设计（生产技术）。它是大规（过渡）和生物反应器设计（生产技术）。它是大规模生产基因工程药物，单抗和疫苗等生物工程产品的模生产基因工程药物，单抗和疫苗等生物工程产品的关键技术。关键技术。 412 发展历程：发展历程： 413 动物细胞培养的特点与方法：动物细胞培养的特点与方法： A、动物细
3、胞培养的主要特点、动物细胞培养的主要特点 动物细胞对营养要求高动物细胞对营养要求高 血清来源受限，质量不稳，研发无血清来源受限，质量不稳，研发无血清培养液；血清培养液； 动物细胞对培养环境适应性差动物细胞对培养环境适应性差 生长慢，时间长，生长用动物细胞生长慢，时间长，生长用动物细胞需驯化；需驯化； 动物细胞培养对环境条件要求严格动物细胞培养对环境条件要求严格 pH，混合气体（，混合气体（O2、CO2、N2）；）； 动物细胞培养过程易产生污染动物细胞培养过程易产生污染 要求苛刻；要求苛刻； 各种细胞素长期培养易变异各种细胞素长期培养易变异 需监测其形态、生长、表达过程；需监测其形态、生长、表达
4、过程； 绝大多数的哺乳类动物细胞具贴壁依赖性生绝大多数的哺乳类动物细胞具贴壁依赖性生长特征长特征需载体。需载体。 B、动物细胞培养工程的方法、动物细胞培养工程的方法 悬浮培养：螺旋桨或平桨搅拌通用发酵罐悬浮培养：螺旋桨或平桨搅拌通用发酵罐 适应淋巴细胞、骨髓瘤细胞等适应淋巴细胞、骨髓瘤细胞等方方法法 单层培养单层培养 滚瓶法：间歇接触培养液和空气滚瓶法：间歇接触培养液和空气 固定化培养固定化培养 微珠微珠 微载体培养微载体培养 比表面积大比表面积大 中空纤维中空纤维 414 动物细胞培养工程技术现状与展望动物细胞培养工程技术现状与展望 A、70%生物技术产品使用动物细胞生产；生物技术产品使用动
5、物细胞生产； B、生产技术、工艺条件改变明显：、生产技术、工艺条件改变明显： 培养方式：从固着贴壁式变为悬浮式、从间歇式变培养方式：从固着贴壁式变为悬浮式、从间歇式变 为悬浮连续式；为悬浮连续式； 培养介质：用动物血清变为无血清无蛋白培养液；培养介质：用动物血清变为无血清无蛋白培养液； 生物反应器控制：从黑箱式到计算机到人工智能。生物反应器控制：从黑箱式到计算机到人工智能。 C、中国与美国动物细胞工程技术比较（见表）、中国与美国动物细胞工程技术比较（见表） 中国，实验室规模中国，实验室规模 流加工艺：产量高易放大、操作简单，流加工艺：产量高易放大、操作简单，美国，产业美国，产业 如如Genen
6、tech、IDEC、化规模生产化规模生产 MedImmune、 Merk公司，公司， 蛋白质公司蛋白质公司 连续灌注工艺：适合不稳定产品、连续灌注工艺：适合不稳定产品、 培养利用低、操作复杂、培养利用低、操作复杂、 产品回收大，如：产品回收大，如：Genzyme、 Genetic Institute、 Bayer公司公司 中中 国国美美 国国批式培养批式培养（batch）2-100L中试规模中试规模产业化手段；产业化手段；12000L工业反应器工业反应器流加培养流加培养（fed batch）5-500L中试规模中试规模产业化手段；产业化手段；12000L工业反应器工业反应器灌注培养灌注培养（p
7、erfusion）5-30L中试规模中试规模产业化手段；产业化手段；12000L工业反应器工业反应器D、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要 的关键技术之一；的关键技术之一；（10000L规模、规模、g/L级）级）E、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决：、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决： 去除培养环境中外源因子的污染去除培养环境中外源因子的污染 在线检测与工艺控制，如在线检测与工艺控制，如O2限定与溶解限定与溶解CO2尝试累尝试累 积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用42 生产用动
8、物细胞系生产用动物细胞系 421 生产用动物细胞发展：生产用动物细胞发展： 生产用动物细胞生产用动物细胞是指按生产条件是指按生产条件选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的历史演化。历史演化。422 生产用动物细胞的来源生产用动物细胞的来源423 常用生产用动物细胞的特性（参见下表）常用生产用动物细胞的特性（参见下表） 424 生产用动物细胞库生产用动物细胞库 生产用动物细胞库生产用动物细胞库:是
9、指为保证生产用动是指为保证生产用动物细胞有稳定和高水平的质量和生物安全性，物细胞有稳定和高水平的质量和生物安全性，能够长期、稳定地生产出符合要求的高质量能够长期、稳定地生产出符合要求的高质量生物制品的储蓄系统。目前，已经制定有三生物制品的储蓄系统。目前，已经制定有三级细库系统相应保存管理措施（档案和技术级细库系统相应保存管理措施（档案和技术标准）。标准）。 bu425 生产用动物细胞代谢工程优化改造生产用动物细胞代谢工程优化改造 A、原因：、原因：与原核细胞、酵母细胞、昆虫细与原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞相比，动物细胞表达的外源蛋白质最接近胞相比，动物细胞表达的外源蛋白质最接近天然构想，其生物
10、自身的生长代谢特性并非天然构想，其生物自身的生长代谢特性并非最佳，为提高培养细胞活性和单位细胞的产最佳，为提高培养细胞活性和单位细胞的产率，延长培养周期，必须采用代谢工程方法率，延长培养周期，必须采用代谢工程方法优化改选宿主细胞，对细胞自身的遗传特性优化改选宿主细胞，对细胞自身的遗传特性进行功利性修饰。进行功利性修饰。B、代谢工程（、代谢工程（metabolic engineering）：）： 是通过是通过DNA重组技术和分子生物学手重组技术和分子生物学手段改变酶系功能或物质转动功能，以改段改变酶系功能或物质转动功能，以改进细胞某些方面的代谢活性，进行精确进细胞某些方面的代谢活性，进行精确目标
11、的遗传操作。目标的遗传操作。 C、具体优化改选措施：、具体优化改选措施： 构建在无血清、无蛋白条件下增殖的细构建在无血清、无蛋白条件下增殖的细胞株，实现无血清无蛋白培养；（血清胞株，实现无血清无蛋白培养；（血清是基本添加物，但含未确定成分，如有是基本添加物，但含未确定成分，如有毒的多胺氧化酶，成本高，来源少，易毒的多胺氧化酶，成本高，来源少，易污染）污染） 敲除或引入动物细胞的乳酸脱氢酶和谷氨敲除或引入动物细胞的乳酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶，减少代谢产物乳酸和氨的产酰胺合成酶，减少代谢产物乳酸和氨的产生，以改变细胞能量代谢途径；生，以改变细胞能量代谢途径； 引入粘附因子纤粘连蛋白、层粘连蛋白、引
12、入粘附因子纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原或玻璃粘连蛋白，促进细胞贴壁性；胶原或玻璃粘连蛋白，促进细胞贴壁性； 构建抗细胞凋亡工程细胞系，增强细胞对构建抗细胞凋亡工程细胞系，增强细胞对恶劣培养条件的抵抗力。（参见下图）恶劣培养条件的抵抗力。（参见下图） 将细胞周期蛋白激酶（将细胞周期蛋白激酶（CDK）抑制蛋）抑制蛋白基因白基因p21和和p27引入细胞，获得细胞周引入细胞，获得细胞周期增殖控制的表型，通过调控细胞增殖期增殖控制的表型，通过调控细胞增殖周期达到调控细胞增殖目的；（参见下周期达到调控细胞增殖目的；（参见下图）图） 导入外源性糖基转移酶基因，改变细导入外源性糖基转移酶基因，改变细胞的糖链合
13、成能力，改善重组蛋白糖基胞的糖链合成能力，改善重组蛋白糖基化修饰。化修饰。 43 培养液培养液与培养与培养环境环境431 动物细胞动物细胞培养条件培养条件 432 动物细胞培养液和添加剂动物细胞培养液和添加剂 433 无血清无蛋白培养无血清无蛋白培养 优点：化学组分明确，批次间重复性优点：化学组分明确，批次间重复性 好，易检测，适合特定过程；好，易检测，适合特定过程； 缺点：比较贵，针对性强。缺点：比较贵，针对性强。434 动物细胞培养用生物反应器动物细胞培养用生物反应器 435 培养环境与生物反应器培养环境与生物反应器 A、原因、原因 动物细胞生长、代谢和产物生成受培养环动物细胞生长、代谢和
14、产物生成受培养环境的控制，而生物反应器提供的培养环境境的控制，而生物反应器提供的培养环境能否满足需要，直接与能否满足需要，直接与反应器的型式、操反应器的型式、操作状态作状态有关；有关； 为了给细胞生长提供为了给细胞生长提供足够的溶氧水平和均足够的溶氧水平和均一的培养环境一的培养环境，必须使反应器的保持一定，必须使反应器的保持一定的的混合混合水平和水平和通气通气条件；条件； 动物细胞较大、无壁，它对流体作动物细胞较大、无壁，它对流体作用力敏感（剪切敏感性），易损，所用力敏感（剪切敏感性），易损，所以，反应器的设计、放大和操作过程以，反应器的设计、放大和操作过程必须解决必须解决供氧混合供氧混合与与
15、细胞损伤细胞损伤间的矛间的矛盾；盾； 必须了解生物反应器的必须了解生物反应器的传质与混合传质与混合特性、培养环境特性、培养环境液体力学液体力学现象对动物现象对动物细胞生长、代谢及细胞操作的影响；细胞生长、代谢及细胞操作的影响； B、具体关系：、具体关系： 动物细胞对培养环境传质和混合的要求动物细胞对培养环境传质和混合的要求 对于大规模动物细胞培养过程，其生物反应器提供的细胞培养环对于大规模动物细胞培养过程，其生物反应器提供的细胞培养环境必须满足细胞生长、代谢和产物生成对传质和混合的要求，主要境必须满足细胞生长、代谢和产物生成对传质和混合的要求，主要因素是细胞生长对氧的要求；因素是细胞生长对氧的
16、要求； 反应器的传质能力必须满足：反应器的传质能力必须满足：KLA（C*O2-CO2min）qO2C，其中，其中， KL液体一侧氧传质系数，液体一侧氧传质系数，A气液比表面积，气液比表面积， qO2单位细胞耗速率，单位细胞耗速率，C细胞密度，细胞密度， C*O2液体中氧的饱和浓度，液体中氧的饱和浓度，CO2min液体中最低氧浓度。液体中最低氧浓度。 一般而言，一般而言，提高反应器的能量输入，如增加搅拌转速和通气量提高反应器的能量输入，如增加搅拌转速和通气量 减少气泡直径等，有利于提高传质速率，但增加细减少气泡直径等，有利于提高传质速率，但增加细 矛盾矛盾 胞操作速率胞操作速率 生物反应器设计和
17、操作参数对传质系数有影响：生物反应器设计和操作参数对传质系数有影响： 传质系数传质系数（KL）受氧在培养液中的扩散速度影响，受氧在培养液中的扩散速度影响， 气泡大小可改变传质系数与扩散系数相互关系，气泡大小可改变传质系数与扩散系数相互关系，鼓泡式鼓泡式 小气泡（小气泡（2.5mm）传质系数与扩散系数的）传质系数与扩散系数的 1/2次方成正比。次方成正比。 传质比表面积传质比表面积（A）与通气量成正比，而与气泡直径与通气量成正比，而与气泡直径 的三次方成反比，如增加气量、的三次方成反比，如增加气量、 减少气泡直径，会提高细胞死亡率减少气泡直径，会提高细胞死亡率 实际要优化细胞破损与供氧混合过程，
18、在最大限度满足细胞对实际要优化细胞破损与供氧混合过程，在最大限度满足细胞对传质要求的前提下，减少细胞破损。传质要求的前提下，减少细胞破损。 传质系数传质系数（KL）氧传质系数仍与扩散氧传质系数仍与扩散 系数的系数的2/3次方成正比，但流体主体次方成正比，但流体主体通气搅拌通气搅拌 的湍（的湍（tuan）流强度对传质系数也有贡献）流强度对传质系数也有贡献 生物反应器生物反应器 气液传质比表面积气液传质比表面积（A）气泡直径和传气泡直径和传 质比表面积主要与搅拌功率和通气质比表面积主要与搅拌功率和通气 量有关量有关 强化传质和抑制细胞损伤，达到合适度（优化）强化传质和抑制细胞损伤，达到合适度（优化
19、） 决定动物细胞剪切敏感性的因素：决定动物细胞剪切敏感性的因素： 不同不同细胞剪切敏感性细胞剪切敏感性不一，人细胞最敏感，细胞表面形不一，人细胞最敏感，细胞表面形 态与功能特性（细胞膜流动性）直接决定细胞剪切态与功能特性（细胞膜流动性）直接决定细胞剪切 敏感性，流动性越强，剪切越敏感，如杂交瘤细胞；敏感性，流动性越强，剪切越敏感，如杂交瘤细胞； 细胞骨架结构影响细胞骨架结构影响细胞耐剪切能力细胞耐剪切能力； 细胞所处生长期（生理状态）对细胞耐受剪切力有影响。细胞所处生长期（生理状态）对细胞耐受剪切力有影响。 微载体细胞培养系统中的细胞损伤微载体细胞培养系统中的细胞损伤微载体湍流涡旋微载体湍流涡
20、旋 相互作用是主要因素；相互作用是主要因素； 悬浮细胞在生物反应器中的细胞损伤悬浮细胞在生物反应器中的细胞损伤鼓泡式、气升鼓泡式、气升 式相对温和，决定于式相对温和，决定于气泡聚并与破裂速率气泡聚并与破裂速率； 防止细胞机械破裂的培养液成分防止细胞机械破裂的培养液成分 44 动物细胞培养工艺动物细胞培养工艺 动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的生产工艺；生产工艺； 动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点，动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点， 其培养工艺过程也不同；其培养工艺过程也不同； 动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身
21、的生长特点、动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身的生长特点、生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑，生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑，以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环境和各种参数控制指标等；境和各种参数控制指标等； 目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：流加培养工流加培养工艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。 441 动物细胞培养工艺基础动物细胞培养工艺基础 实验室规模（实验室规模（laboratory sca
22、le） A 、工艺实验研修阶段、工艺实验研修阶段 中试规模（中试规模（pilot scale） 生产规模（生产规模（production scale） 实验室设施实验室设施B、实验室管理、实验室管理 选址、装修、净化、布局选址、装修、净化、布局 无菌室管理（国家相关法规）无菌室管理（国家相关法规） D、无菌操作技术、无菌操作技术 培养前准备、培养室和超净台的消毒、洗手与着装培养前准备、培养室和超净台的消毒、洗手与着装 无菌培养操作、生物反应器的安装与消毒无菌培养操作、生物反应器的安装与消毒 442 动物细胞培养方法动物细胞培养方法 原代细胞原代细胞 依细胞来源，可分依细胞来源，可分 传代细胞培
23、养传代细胞培养 液体培养液体培养 依培养液种类不同，可分依培养液种类不同，可分 固定培养固定培养 静止培养、旋转培养、搅拌培养静止培养、旋转培养、搅拌培养 依反应器类型和操依反应器类型和操 中空纤维培养中空纤维培养 作方式不同，可分作方式不同，可分 固定床或流化床培养固定床或流化床培养 悬浮培养悬浮培养 依在反应器生长依在反应器生长 贴壁培养贴壁培养 形式不同，可分形式不同，可分 贴壁贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）悬浮培养（假悬浮培养） A、悬浮培养、悬浮培养（suspension culture）：）： 是指细胞自由地悬浮于培养液内生长是指细胞自由地悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法；适用于
24、悬浮培养的增殖的一种培养方法；适用于悬浮培养的生产细胞有杂交瘤与骨髓瘤细胞（生产细胞有杂交瘤与骨髓瘤细胞（SP2/0，NSO），不适用于正常细胞培养。此种方），不适用于正常细胞培养。此种方法操作简便，传质比较好，易放大，条法操作简便，传质比较好，易放大，条件均一；但需产物截流。件均一；但需产物截流。1996-2000年，年，美国，美国，FDA批准批准70%重组治疗药物。重组治疗药物。用重组技术或细胞融合技术建立的工程用重组技术或细胞融合技术建立的工程细胞系，在进行无血清悬浮培养或高密度细胞系，在进行无血清悬浮培养或高密度培养时，都需经过一定时间的细胞适应能培养时，都需经过一定时间的细胞适应能力
25、驯化；力驯化；细胞对无血清培养条件的适应能力和生细胞对无血清培养条件的适应能力和生长形式的驯化，对于建立优化的无血清高长形式的驯化，对于建立优化的无血清高密度培养工艺非常重要；密度培养工艺非常重要； 通过驯化期可以逐渐修复那些不适应的细胞群通过驯化期可以逐渐修复那些不适应的细胞群体，在驯化过程中监控并筛选那些具有优化性能体，在驯化过程中监控并筛选那些具有优化性能特性（如细胞生长率、产出率、细胞死亡率、基特性（如细胞生长率、产出率、细胞死亡率、基因稳定性等）的细胞克隆或细胞群；因稳定性等）的细胞克隆或细胞群；悬浮培养悬浮培养 无血清培养条件的驯化无血清培养条件的驯化 的驯化的驯化 高细胞密度培养
26、的驯化高细胞密度培养的驯化 主要包括主要包括 （时间、难度不一）（时间、难度不一） 贴壁生长转化为悬浮生长的驯化贴壁生长转化为悬浮生长的驯化B、贴壁培养、贴壁培养（anchorage-dependent culture） 是指让细胞贴附在某种基质上进行增殖的培养是指让细胞贴附在某种基质上进行增殖的培养方法。主要适用于贴壁细胞或兼性贴壁细胞，如方法。主要适用于贴壁细胞或兼性贴壁细胞，如CHO、BHK、Vero等，用灌流培养模式可维持较等，用灌流培养模式可维持较长的培养周期，关键是提高细胞密度，进行放大培长的培养周期，关键是提高细胞密度，进行放大培养；适于贴壁依赖性和非依赖性细胞。养；适于贴壁依赖
27、性和非依赖性细胞。 优点：易于灌注和优化控制，细胞生长密度高，优点：易于灌注和优化控制，细胞生长密度高，产率高，产物易收取和纯化，培养液利用率高；产率高，产物易收取和纯化，培养液利用率高； 433 动物细胞培养的操作方式动物细胞培养的操作方式 444 培养过程的监测与控制培养过程的监测与控制445 动物细胞培养工艺动物细胞培养工艺446 工艺的选择与设计工艺的选择与设计（反应器投入占整个部分（反应器投入占整个部分50%）B、生产工艺的设计原则、生产工艺的设计原则447 杂交瘤细胞大规模培养制备杂交瘤细胞大规模培养制备 抗体的工艺抗体的工艺A、工艺流程图、工艺流程图肝癌单抗片段肝癌单抗片段Hab
28、18F（ab/）2体外制备工艺体外制备工艺B、主要设备、主要设备 1L悬浮搅拌培养瓶悬浮搅拌培养瓶Superspinner（德，（德，BraunBiotech） 杂交瘤细胞悬浮培养种子细胞杂交瘤细胞悬浮培养种子细胞 （磁力搅拌无气泡供气，（磁力搅拌无气泡供气，10um细胞连续细胞连续 旋转过滤器，其它全控）旋转过滤器，其它全控） 5L细胞发酵罐（德国，细胞发酵罐（德国，BraunBiotech） 杂交瘤细胞连续悬浮培养杂交瘤细胞连续悬浮培养 30L细胞发酵罐细胞发酵罐BiostatRC20（德国，（德国，BraunBiotech）（冷热循环蒸汽控温，四气混合控制供气）（冷热循环蒸汽控温，四气混
29、合控制供气） 杂交瘤细胞连续悬浮培养的放大杂交瘤细胞连续悬浮培养的放大 生物反应器生物反应器生物反应器的操作生物反应器的操作生物反应器的监控系统生物反应器的监控系统生物反应器连接和排流管道生物反应器连接和排流管道低温调整离心机低温调整离心机系统控制面板系统控制面板国产生物反应器及操作国产生物反应器及操作C、无血清流加培养工艺、无血清流加培养工艺45 动物细胞培养过程的动物细胞培养过程的 放大与优化放大与优化451 动物细胞培养工艺的研究动物细胞培养工艺的研究A、开发重要性：、开发重要性：真核细胞表达产物糖基化，有疗效；真核细胞表达产物糖基化，有疗效；动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病
30、毒疫动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，研发成本高，技术难度大；如：美国，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公公司，已被司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白药物，药物，26g/人、年人、年6154美元美元/g=16000美元，美元，2002年，销售额达年，销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失亿美元，其中，被替代损失10亿，因亿，因为产量低，计划投入数亿美元，耗时为产量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规年，扩大规模
31、、优化生产工艺，提高产量模、优化生产工艺，提高产量B、主要内容：、主要内容： 生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性C、初步研究：、初步研究： 首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细胞培养工艺。胞培养工艺。452 动物细胞培养工艺的优化动物细胞培养工艺的优化A、影响蛋白质产量的关键参数，、影响蛋白质产量的关键参数， 营养物耗尽；营养物耗尽；B、决定细胞浓度、决定细胞浓度 有毒废物的积累有毒废物的积累 的关键参数的关键参数 培养物理条件的恶化培养物理条件的恶化 提高蛋白质表达水平提高蛋白质表达水平C、细胞
32、培养工艺、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制细胞新陈代谢的控制 优化策略优化策略 流加工艺的优化流加工艺的优化453 动物细胞培养工艺的放大动物细胞培养工艺的放大A、生物反应器尺寸放大、生物反应器尺寸放大 鼓泡鼓泡B、氧气的传输、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法提高氧气传递的其它方法 搅拌速率和搅拌器的设计搅拌速率和搅拌器的设计C、混合、混合 剪切力和细胞损伤剪切力和细胞损伤D、工业生产中的动物细胞培养、工业生产中的动物细胞培养 46 动物细胞代谢工程动物细胞代谢工程461 概述概述 A、生命的代谢活动、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化群
33、的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网络相对实际应用而言，其遗传特性并非最络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳，需要对细胞代谢途径进行修饰；佳，需要对细胞代谢途径进行修饰；B、代谢控制发酵、代谢控制发酵（metabolic control fermentetion）是指利用遗传学或生物化学方法，人是指利用遗传学或生物化学方法，人为地在为地在DNA分子水平上改变和控制微生物分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的的代谢，使目
34、的产物大量的生成、积累的发酵；发酵；C、在代谢控制发酵的理论、在代谢控制发酵的理论基础上，提出基础上，提出和形成了和形成了“代谢工程代谢工程”概念；概念；D、代谢工程、代谢工程（也称途径工程，（也称途径工程，pathway engineering）是指应用重组是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、
35、遗传操作和目的代（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络有目的地被修饰。有目的地被修饰。462 基本原理基本原理A、代谢网络理论、代谢网络理论细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又互相协调；精密调节，又互相协调；代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔性节点；
36、性节点；柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断； 生物合成相关代谢调节和调节网络理论生物合成相关代谢调节和调节网络理论 代谢工程代谢工程 代谢流及节点分析代谢流及节点分析 理论涉及理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要内容主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析中心代谢产物作用机制及相关代谢分析B、代谢流及中间产物分析、代谢流及中间产物分析静态分析静态分析C、代谢控制分析、代谢控制分析动态分析动态分析463 代谢调节的基本类型及其机制
37、代谢调节的基本类型及其机制A、代谢调节的基本类型、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制协作式多价反馈控制 合作反馈控制合作反馈控制 累积反馈控制累积反馈控制 顺序反馈控制顺序反馈控制 同工酶控制同工酶控制B、酶合成及酶活性的调节机制、酶合成及酶活性的调节机制 末端代谢产物阻遏末端代谢产物阻遏酶的阻遏酶的阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏酶合成的分解代谢物阻遏和酶的诱导和酶的诱导 酶的诱导与合成酶的诱导与合成 变构变构 酶活性的调节酶活性的调节 同工同工 多功能酶多功能酶 464 代谢工程的研究方法代谢工程的研究方法 A、设计思路改变代谢流、设计思路改变代谢
38、流 扩展代谢途径和构建新的代谢途径扩展代谢途径和构建新的代谢途径 常规方法常规方法分子生物、生化、物化分子生物、生化、物化 代谢通量分析（代谢通量分析（MFA） 静态静态B、研究、研究 代谢控制分析（代谢控制分析（MCA） 动态动态 方法方法 代谢网络代谢网络 生化系统理论（生化系统理论（BST） 最优化原理最优化原理 定量分析定量分析 控制论模型（控制论模型（CM） 非线性非线性 途径分析途径分析途径定位途径定位 细胞代谢模型细胞代谢模型C、代谢模型的、代谢模型的 发展与优化发展与优化 神经网络神经网络 计算生物学方法计算生物学方法 遗传算法遗传算法 D、逆代谢工程、逆代谢工程 47 动物细
39、胞工程产品制备及质控动物细胞工程产品制备及质控 471 动物细胞工程产品制备动物细胞工程产品制备 A、初级分离、初级分离离心、过滤、吸附离心、过滤、吸附 B、纯化、纯化色谱法色谱法 C、制剂与冷冻干燥、制剂与冷冻干燥472 动物细胞工程产品的质量控制动物细胞工程产品的质量控制 PAGE 纯度纯度 SDS-PAGE 液相色谱液相色谱 A、物化指标测定、物化指标测定 含量含量 B、安全性评介、安全性评介 分子量分子量 C、稳定性、稳定性 48 动物细胞工程表达产品的应用动物细胞工程表达产品的应用 481 重组蛋白药物重组蛋白药物 A、组织型纤溶酶原活化剂（、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体）
40、突变体 Tenecteplase，商品名，商品名TNKaseTM， 急性心肌梗死病人溶栓治疗，急性心肌梗死病人溶栓治疗， 人人t-PA基因位于基因位于8号染色体号染色体p12-q11.2， 全长全长36594bp，14个外显子，个外显子，13个内含子，个内含子， t-PA由由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始个氨基酸，单链糖蛋白，开始 酵母表达，不能分离纯化酵母表达，不能分离纯化 t-PA突变体，由双链糖蛋白，突变体，由双链糖蛋白， 现用现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）细胞高效表达成功（参见下图） B、-干扰素（干扰素（IFN-） 最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病最早，为一种在同种细胞
41、上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化， 天然天然IFN-刺激体外培养人成纤维细胞，刺激体外培养人成纤维细胞， 大肠杆菌表达，活性低，不稳定，大肠杆菌表达，活性低，不稳定， Cys17形成二硫键，缺少形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化，无糖基化 重组重组IFN- 点突变改造，使点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸，变
42、为中性氨基酸， 如：丝、酪氨酸，商品名为：如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化，细胞表达，与天然一样，天然糖基化， 分离简单。分离简单。 C、新型红细胞生成刺激蛋白（、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）D、血友病、血友病缺少凝血因子缺少凝血因子（F）或含量过低疾病）或含量过低疾病482 MAb药物（参见下图）药物（参见下图） 因为体内同一抗原具多个表位，刺因为体内同一抗原具多个表位，刺 激机体产生不同抗体（多克隆抗体）激机体产生不同抗体（多克隆抗体） 杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具 有高度均一性，抗原识别专一性的有高度
43、均一性，抗原识别专一性的MAb， 降低抗原识别交叉反应；降低抗原识别交叉反应； 483基因工程与亚单位疫苗基因工程与亚单位疫苗 A、乙肝疫苗（参见下图）、乙肝疫苗（参见下图） 衣壳衣壳衣壳表面抗原（衣壳表面抗原（HBsAg），）， 核心抗原核心抗原 核心抗原（核心抗原（HBcAg）、）、e抗原（抗原（HBeAg）和核酸）和核酸 第一代疫苗，血中提取，弱反应，第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应，不产生反应， 81-82年，美法，年，美法，85年，中国年，中国 第二代疫苗，在哺乳细胞或第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，细胞表达，81年，年， 法美，法美，91、92年，中国年，中国
44、 第三代疫苗，第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），抗原（重要作用），CHO细胞表达细胞表达 B、艾滋病疫苗（参见下图）、艾滋病疫苗（参见下图） CHO表达疫苗表达疫苗理论上，有致瘤性理论上，有致瘤性昆虫细胞表达疫苗昆虫细胞表达疫苗昆虫细胞昆虫细胞-杆状病毒表达系统杆状病毒表达系统 （安全性好，容量大，表达效率高）（安全性好，容量大，表达效率高） C、肿瘤疫苗、肿瘤疫苗 灭活自体肿瘤细胞灭活自体肿瘤细胞 对细胞因子基因修饰，对细胞因子基因修饰，主动主动 加强疫苗免疫原性加强疫苗免疫原性 免疫免疫 同种异体的肿瘤细胞同种异体的肿瘤细胞 树突状细胞（抗原提呈细胞）树突状细胞（抗原提呈细胞） 体内外
45、诱导体内外诱导CTL生成生成 激发特异性抗肿瘤免疫功能激发特异性抗肿瘤免疫功能484 基因治疗产品基因治疗产品 基因治疗（基因治疗（gene therapy）是指把外界是指把外界的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导，法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导，还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行
46、胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行细胞治疗。细胞治疗。 A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：、神经系统疾病的基因或细胞治疗： B、造血干细胞治疗癌症、造血干细胞治疗癌症 HSC基因（参见下图）基因（参见下图） 胰岛素依赖型（胰岛素依赖型（I）C、细胞、基因、细胞、基因 代谢代谢 治疗糖尿病治疗糖尿病 紊乱紊乱 非胰岛素依赖型（非胰岛素依赖型（II） 【习题】【习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系：、名词解释，并简要说明它们间关系： 单抗与疫苗单抗与疫苗 CHOCHO、BHKBHK与与VeroVero tPA tPA与与EPO EPO 艾滋病疫苗与肿瘤疫苗艾滋病疫苗与肿瘤疫苗2、从多个方面比较动植物细胞与微生物细胞培、从多个方面比较动植物细胞与微生物细胞培 养特性、条件与方式？养特性、条件与方式？3、简述生产用动物细胞系的来源及特点？、简述生产用动物细胞系的来源及特点？4、概述肝癌单抗片段、概述肝癌单抗片段HAB18F(ab)2无血清流无血清流 加培养工艺技术流程？加培养工艺技术流程？