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1、第二章基因工程的工具酶第1页，此课件共28页哦1.工具酶的概念工具酶的概念应用与基因工程的各种酶的总称应用与基因工程的各种酶的总称.大量应用的是核酸酶大量应用的是核酸酶.切切:限制性内切酶限制性内切酶连连:DNA连接酶连接酶修饰酶，聚合酶修饰酶，聚合酶第2页，此课件共28页哦http:/ Escherichia coli流感嗜血菌 Haemophilus influenzae短杆菌 Brevibacterium albidum 粘质沙雷式菌 Serratia marcescens第6页，此课件共28页哦同一菌种具有不同的菌株或菌型基本名称 菌株或菌型(小写)大肠杆菌k型菌株 Ecok流感嗜血菌
2、d型菌株 Hind限制酶由染色体外的成分，如病毒、质粒等引起基本名称 质粒、病毒的辅助字母EcoR第7页，此课件共28页哦某一菌株具有多个不同的限制酶体系，用罗马字母表示发现的先后顺序Hind II:EcoR I:第8页，此课件共28页哦有的限制酶前冠以系统名R：限制性核酸内切酶，常省略M：甲基化酶R.Hind IIIM.Hind III第9页，此课件共28页哦限制酶的识别位点II型限制酶的识别系统识别46个碱基对，一般富含GC；少数识别6个以上的碱基对，为稀有酶识别序列具有回文结构识别序列严格，少数仅识别一二位专一第10页，此课件共28页哦限制酶剪切方式产生5突出的黏性末端产生5突出的黏性末
3、端产生平齐末端第11页，此课件共28页哦II型限制酶的反应条件U-一个单位的限制性内切酶合适的温度和缓冲液，20 ul体系，1 h降解1ug DNA所需酶量注意酶的稀释与保存第12页，此课件共28页哦影响限制酶活性的因素DNA纯度DNA甲基化程度酶切反应的温度DNA的分子结构缓冲液第13页，此课件共28页哦3.DNA连接酶连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的端连接起来，使之成为一个完整的DNA分分子。子。在在DNA复制、修复及体内外重组过程中起着复制、修复及体内外重组过程中起着重要作用。重要作用。第14页，此课件共28
4、页哦连接机理连接机理一条DNA链上的3游离羟基与另一条DNA链上的5末端磷酸基团形成3,5-磷酸二脂键。第15页，此课件共28页哦DNA连接酶的种类(1).T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 不受不受dNTP的抑制，催化的抑制，催化DNA片断的连接。片断的连接。(2).E.coli DNA连接酶连接酶 不能连接平端不能连接平端DNA,不能连接不能连接RNA。第16页，此课件共28页哦 T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶广泛应用，可以连接：两个带有互补黏性末端的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子一条链带有切口的双链DNA分子RNA-DNA杂合体中RNA链切口，RNA末端与DNA连接第
5、17页，此课件共28页哦DNA连接酶反应体系1230下反应116h。黏性末端：1216，保证退火、酶活性、反应速率间的平衡平头末端：1020，10100倍酶量终止反应：EDTA或75水浴第18页，此课件共28页哦影响连接反应的因素影响连接反应的因素DNA末端的结构DNA片段浓度相对分子量反应温度离子浓度第19页，此课件共28页哦4.DNA聚合酶催化合成DNA的反应的酶第20页，此课件共28页哦DNA聚合酶分类依赖DNA的聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I 大肠杆菌DNA聚合酶I的的Klenow大片段大片段酶T4 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶Taq DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶逆转录酶第2
6、1页，此课件共28页哦依赖DNA的DNA聚合酶(1)大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coli DNA pol I)：具有三种酶活性a、5-3DNA聚合酶活性CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCTGGCTATCGGA Mg2+dNTP GGCTATCGGAb、3-5 外切酶活性-校正作用CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCGGCG Mg2+dNTP GCGc、5-3外切酶活性CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAGGCGTAATC Mg2+GCGTAATC第22页，此课件共28页哦大肠杆菌DNA聚合酶I制备
7、制备杂交探针。杂交探针。Mg2+，低浓度DNA聚合酶I，同位素标记的核苷，同位素标记的核苷酸酸处理双链DNA产生单链DNADNA聚合酶I53外切酶活性和聚合酶活性同外切酶活性和聚合酶活性同时发生，产生时发生，产生切口平移切口平移，形成带标记的，形成带标记的DNA分分子子第23页，此课件共28页哦(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5-3外切酶活性Klenow酶的基本用途：a.补平由核酸内切酶产生的5粘性末端b.DNA片段的同位素末端标记c.cDNA第二链的合成d.双脱氧末端终止法测定DNA序列第24页，此课件共28页哦(3)Taq DNA聚合酶：耐
8、热的DNA聚合酶PCR反应扩增所需酶具5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性（4）逆转录酶体外mRNA为模板合成互补的DNA第25页，此课件共28页哦5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶去除去除DNA或者或者RNA的的5磷酸，可防止自身环磷酸，可防止自身环化。化。5pDNA 5OHDNA 5pRNA 5OHRNA第26页，此课件共28页哦6.末端转移酶末端转移酶分子量分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催化在二价阳离子的作用下，催化dNTP加于加于DNA分子的分子的3羟基端。羟基端。底物：底物：带带3羟基端单链羟基端单链DNA或带或带3羟基突出端的羟基突出端的双链双链DNA。第27页，此课件共28页哦7.核酸酶核酸酶S1S1核核 酸酸 酶酶 的的 基基 本本 特特 性性：来来 自自 稻稻 谷谷 曲曲 霉霉 菌菌（Aspergillus oryzae）水水解解单单链链核核酸酸以以及及双双链链核核酸酸中中的的单单链链区区或或单单链链末末端端，产产生生5核苷酸和核苷酸和5末端为末端为p的寡核苷酸。的寡核苷酸。Zn2+必需必需,最适最适pH范围为范围为4.0-4.3,需要需要NaCl 10-300 mM.降解单链降解单链DNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNA快快75000倍倍第28页，此课件共28页哦