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1、湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 第二章第二章 基因工程工具酶基因工程工具酶 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲袁婺洲 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 本章目录本章目录 2.1 2.1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 2.22.2 DNADNA连接酶连接酶 2.32.3 DNADNA聚合酶类聚合酶类 2.4 2.4 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 2.5 2.5 末端转移酶末端转移酶 2.6 2.6 其他工具酶其他工具酶 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学
2、院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶 识别双链识别双链DNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNA双双链链 1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶（W. Arber） 19197070年，年， 美国约翰 霍布金斯大学 H. Smith 偶然从流感从流感嗜血杆菌嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出 Hind IIHind II和和Hind III Hind III 主要存在于原核细菌中，细菌的限制与修饰作用主要存在于原核细菌中，细菌的限制与修饰作用，帮助帮助细菌限制外来细菌限制外来DNADNA的入侵的入侵 湖南师范大学生
3、命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d株株 属名属名 种名种名 株名株名 H i n d III 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 限制性核酸内切酶的3种类型 2 0 1 9 种类种类 型型 型型 型型 识别位点识别位点 非对称非对称 4-8bp,对对称称 5-7bp,非非对称对称 切割位点切割位点 无特异性无特异性 特定位点特定位点 识别位点识别位点下游下游 限制与修限制与修饰饰 互斥互斥 分开
4、分开 竞争竞争 是否需要是否需要ATP 需要需要 不需要不需要 需要需要 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 II II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链识别双链DNA分子中分子中4 - 8对碱基对碱基的特定序列的特定序列 （基因组（基因组DNA上的分布频率？）上的分布频率？） 识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构 大部分酶的大部分酶的切割位点切割位点在识别序列内部或两侧在识别序列内部或两侧 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2
5、 0 1 9 型限制酶识别序列短 Sau3A：GATC（44） EcoR：CCWGG（W表示表示A或或T 45） EcoR：GAATTC （46） BbvC：CCTCAGC （47） Not： GCGGCCGC （48） 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 0 回文结构 DNA左右： 53 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 EcoREcoRI I等产生等产生55粘性末端粘性末端, ,PstPstI I等产生等产生33粘性末端粘性末端Pvu Pvu I II I等产生平头末端等产生平头末端
6、湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 同位异切酶，即识别相同的序列但切割位点不一样。如Sma I和Xma I，识别的序列相同，都为CCCGGG，而切割位置不同，Xma I为错切CCCGGG，而Sma I为平切CCCGGG。 同尾酶，即识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。如Mbo I/ Bgl II/Bcl I/BamH I，它们的识别位点分别为GATC/AGATCT/TGATCA/GGATCC，但切出相同的DNA末端5GATC3和3CTAG5。 同位同切酶，即识别位点和切割位点均相同的酶。如BamH I/Bst I,识别序列和切
7、割位点都相同：GGATTC。 同尾酶同尾酶与与同裂酶同裂酶 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 1)1) 温度温度：最适反应温度为37，Sma I的反应温度为25。 2)2) 盐离子浓度盐离子浓度：低(0mmol/L)、中(50mmolL)、高盐(100mmolL)三类。双酶切或多酶切时，一般先用低盐浓度的酶切，再用高盐浓度的酶切。 3)3) 缓冲体系缓冲体系：TrisHCl缓冲体系. 4)4) 反应体积和甘油浓度反应体积和甘油浓度：50甘油作为保护剂，一般在-20下贮藏。 5)5) 限制性核酸内切酶反应的时间限制性核酸内切酶反应的时间：通
8、常为1h. 6)6) DNADNA的纯度：的纯度：DNA样品中所含蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均会影响酶切反应的速度和酶切的完全程度。 7 7）终止酶切：）终止酶切：EDTA或加热 8 8）星星活性：）星星活性：非标准条件下，切割相似的序列 影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 二、二、DNADNA连接酶连接酶 作用：负责双链DNA中相邻3-OH与5-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 连接酶
9、的作用方式 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 相同粘性末端的连接相同粘性末端的连接 正连反连正连反连都存在都存在 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 双酶切末端的连接双酶切末端的连接 只有一种只有一种连接方向连接方向 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 不同不同5 5粘性末粘性末端的连端的连接接 先补平再先补平再连接连接 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 不同不同3 3粘性末端
10、的连接粘性末端的连接 先切平再先切平再连接连接 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 平末端的连接平末端的连接 先加人工粘性先加人工粘性末端再连接末端再连接 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 连接酶连接切口连接酶连接切口DNADNA的最适反应温度是的最适反应温度是3737C C。但是这个温。但是这个温度下，粘性末端之间退火形成的氢键结合是不稳定的。度下，粘性末端之间退火形成的氢键结合是不稳定的。 一般粘末端连接反应的最适温度认为一般粘末端连接反应的最适温度认为4 41515C C比较合适
11、。比较合适。但是温度越低，连接反应速度越慢，效率越低，通常使用但是温度越低，连接反应速度越慢，效率越低，通常使用的连接反应温度的连接反应温度1616C C。 DNADNA连接酶的反应条件：连接酶的反应条件： 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 E.coli DNA聚合酶 I Klenow 片段 T4 DNA 聚合酶 T7 DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶 反转录酶 三、三、DNA聚合酶类（聚合酶类（DNA Polymerase） 53 53DNA聚合酶 5533dNTP 2 0 1 9 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工
12、工 程程 2 0 1 9 1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I的基本性质：的基本性质： 5 3 的的DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 3 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 3 5 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的基本用途：的基本用途： 缺口前移标记法缺口前移标记法 制备制备32P标记的探针标记的探针 E E. .colicoli 的的DNADNA聚合酶聚合酶系统系统 PolPol I I 参与参与DNADNA修复修复 PolPol IIII 参与参与DNADNA修复修复 PolPol III
13、III参与参与DNADNA复制复制 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 2.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（ Klenow Klenow ） Klenow酶的基本性质：酶的基本性质： 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解经枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解处理，获得处理，获得N端三分之二的大肽段，即为端三分之二的大肽段，即为Klenow酶
14、。酶。 Klenow酶仍拥有酶仍拥有53的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35的核酸外的核酸外切酶活性切酶活性，但失去了，但失去了53的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 8 2.Klenow2.Klenow大片段大片段 用途： （1）补平DNA3凹端 （2）切平DNA3凸端 （3）合成cDNA第二链 （4） Sanger合成测序 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 3.3.耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶 53聚合活性 53外切活性 35外切活性 Taq
15、Taq酶酶 耐高温高保真酶 （1） Vent DNA聚合酶 （2） Pwo DNA聚合酶 （3） Pfu DNA聚合酶 具有35外切活性 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 4.T4 DNA4.T4 DNA聚合酶聚合酶 （1）补平3凹端 （2）切平3凸端 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 5. 5. 反转录酶反转录酶 反转录酶具有： （1）53DNA聚合活性 （2）35RNA外切活性 （3）53RNA外切活性 缺乏35DNA外切活性 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基
16、基 因因 工工 程程 2 0 1 9 用于用于55端标记端标记3232P P 用于防止载体的粘性末端的自连用于防止载体的粘性末端的自连 四、碱性磷酸酶四、碱性磷酸酶 从从DNADNA或或RNARNA的三磷酸核苷酸上除去的三磷酸核苷酸上除去55磷酸根残基磷酸根残基 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（ CIP ） CIP对热敏感对热敏感 来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（ BAP ） OH 3 5 p OH 3 DNA or RNA 5 HO 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 碱性磷酸酶用于
17、碱性磷酸酶用于DNA5DNA5末端标记末端标记 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 碱性磷酸酶防止载体自连碱性磷酸酶防止载体自连 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 7 TdTTdT的基本特性：不需要模板的的基本特性：不需要模板的DNADNA聚合酶，随机掺入聚合酶，随机掺入dNTPsdNTPs；用于人工接头及探针标记用于人工接头及探针标记 五、末端转移酶（五、末端转移酶（TdTTdT） 湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院 基基 因因 工工 程程 2 0 1 9 IIs型限制性核酸酶型限制性核酸酶 Cas核酸内切酶核酸内切酶 Dicer酶酶 重组酶重组酶 六、其他工具酶六、其他工具酶 cDNAcDNA合成合成